[发明专利]一种慢病毒重组穿梭载体的构建

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其一种慢病毒重组穿梭载体的构建。 

背景技术

信号转导是细胞生命活动的一种最基本和最重要的方式，细胞因子受体介导的JAK-STAT-OPN(janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信号传导途径是目前心血管分子生物学研究领域的热点，它把细胞膜上感受的信号直接传递到核内--启动基因转录，环节少而简洁；近来研究表明，JAK-STAT途径是人体内生理和病理反应的共同通路之一，与多种疾病发病及防治密切相关，广泛参与细胞应激、生长、增殖、分化和凋亡等多种生物学效应，是多种细胞因子和生长因子信号转导的重要途径。国内目前有文献对正常及低氧等损害情况下血管平滑肌细胞(VSMC)及微血管内皮细胞中全部JAK和OPN的基因和蛋白表达和变化情况进行了初步的研究。显然深入研究JAK-OPN及其它信号转导系统对探讨疾病发病机制和防治具有重要意义。 

近年来，RNA干扰(RNA interference，RNAi)这一新兴的生物工程技术在疾病的发生、发展及治疗研究领域发挥越来越重要的作用，为人们针对某种基因突变或过表达所引起的疾病治疗提供了新的策略。本研究通过构建慢性病毒重组穿梭载体，并筛选出最佳抑制效率的干扰载体，为进一步研究JAK-STAT-OPN信号通路参与调控血管再狭窄过程中细胞增殖迁移的分子机制及为血管再狭窄的分子靶向治疗奠定了基础。 

发明内容

本发明提供一种慢病毒重组穿梭载体的构建方法。 

慢病毒重组穿梭载体的构建，其步骤为： 

1)根据Gene Bank中mRNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与mRNA及其他基因编码序列无同源性； 

2)设计shRNA模板、正义链模板、反义链模板三条序列，并将设计好的序列送上海生工生物技术有限公司合成； 

3)pLKO.1scramble shRNA载体线性化及回收：将pLKO.1scramble shRNA用AgeI和EcoR I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收，测定线性化载体浓度； 

4)载体与siRNA模板链连接、连接产物的转化、阳性重组克隆的筛选并送测序； 

5)进行干扰效率检测，发现PLKO.1-OPN2干扰效率效果最好，将干扰效率最高的穿梭质粒PLKO.1-OPN2与psPAX2和pMD2.G质粒一起共转293T细胞，转染后48小时后出毒效率最高。 

本发明的优点： 

1)根据GeneBank目的基因mRNA的已知序列，在 http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html，寻找符合特征的靶序列。 

2)针对目的基因我们设计三对shRNA序列，构建了三个重组慢病毒表达载体，并将这些重组载体包装病毒后感染大鼠血管平滑肌细胞，采用Western blot法验证重组慢病毒对靶基因的抑制效率。实验结果显示PLKO.1-OPN2干扰效率 效果最好。 

3)我们选择干扰效率高的PLKO.1-OPN2进行后续研究，为进一步研究JAK-STAT3信号通路在血管平滑肌细胞增殖、凋亡等作用奠定了基础，为抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗提供了新的思路。 

具体实施方式

下面结合具体具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。