[发明专利]一种环氧化物水解酶基因(EH-B)原核表达及手性环氧氯丙烷的制备

说明书

技术领域

本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一种新型B型环氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达，利用生物手性拆分制备手性环氧苯乙烯的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

手性化合物是重要的手性配体，广泛用于各类不对称反应中，特别是在药物合成领域的应用更为广泛。手性环氧氯丙烷是一种重要的有机合成关键中间体，用以制备多种高光学纯度药物中间体和天然产物，如芳氧丙醇胺类药物、环戊酮的衍生物、抗真菌药(S)-霉康灵、阿伐他汀、L-肉碱等。目前，外消旋的环氧氯丙烷价廉易得，而手性环氧氯丙烷的价格昂贵，后者的报价基本在前者6倍以上，因此通过拆分外消旋环氧氯丙烷制备其手性单体具有很大的工业化应用前景。其拆分剐产物3-氯-1，2-丙二也是一种重要的手性合成原料。拆分外消旋环氧氯丙烷的方法可分为化学法和生物法两类：化学法通常使用昂贵的S len-Co催化剂，可获得ee达到99％的(S)-环氧氯丙烷收率可达30％，其缺点是成本高而且环境污染严重。

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase，EC，3.3.2.-)又称环氧化物水合酶或环氧水化酶，是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应1，2-二醇的水解酶类。在化学法和生物法制备手性纯环氧化物的方法中，酶动力学拆分法由于其高的对映体选择一直受成为广大研究者的重视。该酶广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物及微生物体内。环氧化物水解酶是一种不依赖辅因子的酶，其来源广泛，底物谱宽广，对映体选择性高，具有很高的工业化应用前景，对其研究已成为当前研究的热点。

环氧化物水解酶微生物来源广泛，但具有良好手性拆分作用的环氧化物水解酶较少，Botes等以1，2-环氧辛烷为底物从187个菌株中筛选出25个不同属的酵母具有环氧化合物水解酶活性的菌株，Yeates等以硝基环氧苯乙烯为底物从409个菌株中筛选出45个不同属的酵母具有水解底物活性，但只有3个担子菌属菌株酵母的环氧化合物水解酶选择性较高，即毛孢子菌属(Trichosporon)、红冬孢子属(Rhodosporidium)和红酵母属(Rhodotorula)。Furstoss和Archelas等从众多菌株中筛选一株Aspergillus niger LCP 521进行环氧化合物的不对称水解，合成了6，7-双羟基香叶醇。目前对于环氧化物水解酶的研究，主要集中于对原始菌株培养条件的优化以增加产酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技术和蛋白质工程技术来提高环氧化物水解酶的立体选择性。

本发明来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株具有环氧化物水解酶酶活性，提供一种新型B型环氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达。基因工程环氧化物水解酶纯度高、不含其他蛋白酶，立体选择性更强；大肠杆菌表达系统具有高效胞内表达重组蛋白，成本低廉、生产率高、操作简单等优势；且由于一般底物为有机溶剂，酶分子受底物浓度抑制作用，胞内表达宿主菌包膜形成天然保护屏障，更有利于在高底物浓度下进行生物催化，适应工业化生产要求；本发明利用重组环氧化物水解酶制备手性环氧苯乙烯的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种源于Aspergillus usamii E001的新型B类环氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达，利用重组环氧化物水解酶制备手性环氧苯乙烯的方法，为该环氧化物水解酶的产业化生产奠定基础。根据酶的亚细胞定位及底物的特异性将EH分为可溶性环氧化物水解酶(sEH)、微粒体环氧化物水解酶(mEH)，保幼激素环氧化物水解酶(JhEH)，胆固醇环氧化物水懈酶(ChEH)，羟环氧烯酸水解酶(hepoxilinhydrolase)，白三烯A4水解酶(LAH)以及柠檬烯水解酶(LEH)七个亚家族。生物信息学分析表明，来源于宇佐美曲霉E001菌株的一种新型环氧化物水解酶属于微粒体环氧化物水解酶(mEH)类，属于曲霉EH中一类新型环氧化物水解酶。由于与研究较多A.Niger LCP521EH同源性仅为56％，将该酶命名为Aus EH-B，其相应的基因命名为Aus EH-B。Aus EH-B具有较高的催化活性和手性选择性，在手性环氧化物生产中有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。