[发明专利]一种酸敏感双光发射探针、制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及探针领域，特别涉及一种酸敏感双光发射探针、制备方法及其用途。 

背景技术

真核细胞内的pH分布与细胞器特异相关。例如，细胞质是近乎中性的（pH7.2）而溶酶体内则呈酸性（pH 6.0-4.0）。溶酶体内的酸性环境对于真核细胞的内吞、自吞噬、细胞凋亡等过程有重要影响。在诸如细胞成熟、癌细胞扩散等过程中都能观察到溶酶体酸性改变这一现象，因此检测溶酶体pH对于相关科学研究有着重要意义。 

基于单个发光团的单荧光强度法在实际应用中有很多不足，例如样品中探针分布不均匀，样品厚度不均匀等原因导致难以定量测量。与此相比，比率荧光法则由于引入内参而避免了这些问题。含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物在中性环境下没有荧光，而在酸性环境中由于分子内酰胺开环会生成具有强荧光的罗丹明-酰胺，这说明这类罗丹明衍生物是一种对pH有良好响应的染料。然而，基于这种染料的小分子pH比率荧光探针还没有报道。 

目前，市场上已经有一些通过比率测量溶酶体酸度的探针，如Lysosensor (Invitrogen公司产品)。这类产品为含有单一荧光基团，在酸性溶液中发射两种不同波长的荧光。                                                                                                                                  

发明内容

本发明的目的之一是提供一种具有双荧光发射波长的的溶酶体酸度探针。 

本发明利用含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物和丹磺酰基团对pH的不同响应性能，实现灵敏的pH比率测定。 

本发明的酸敏感双光发射探针，其特征在于，含有分子内酰胺环的罗丹明6G和丹磺酰氯通过酰胺键连接在二亚乙基三胺两端。具有如下结构： 

本发明还保护酸敏感双光发射探针的制备方法，步骤为，先由罗丹明6G在二亚乙基三胺经过氨解得到一无色固体；再由丹磺酰氯与所得无色固体反应制备得到Danyl-R6G。

所述的无色固体经过硅胶柱分离纯化步骤得到。 

所述的Danyl-R6G经过过硅胶柱分离纯化步骤得到。 

制备方法具体为10 g罗丹明6G加入到100 ml 二亚乙基三胺，60摄氏度搅拌反应，直至罗丹明6G的颜色消失；向反应液中加入500 ml水，混合液用二氯甲烷萃取；保留有机相。将加热有机相，除去溶剂所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到一无色固体；将该无色固体加入100 ml二氯甲烷,然后加入3 g丹磺酰氯与10 ml三乙胺；室温搅拌反应2小时；加热有机相，除去溶剂，所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到Danyl-R6G。 

本发明还保护酸敏感双光发射探针用于检测细胞内溶酶体pH值的用途。 

本发明提供一种具有通过能够在细胞溶酶体内聚集的、通过含有胺基的连接臂将丹磺酰氯与含有分子内酰胺环的罗丹明6G连接在一起的探针。利用探针内罗丹明6G-内酰胺环和丹磺酰基团对pH的不同响应特性，利用含有胺基连接臂能够富集在细胞溶酶体的特性，实现该探针在溶酶体内的富集以及溶酶体pH的比率测定。 

本发明探针的制备方法为：先由罗丹明6G在二亚乙基三胺经过氨解得到一无色固体；再由丹磺酰氯与所得无色固体反应生成丹磺酰胺-二亚乙基三胺-罗丹明6-内酰胺（简称Danyl-R6G） (见图1的Dansyl-R6G的合成路线图)。 

所述探针检测溶酶体pH值的应用(图2为Dansyl-R6G的pH检测原理)：在磷酸缓冲液环境中通过荧光放射光谱的方法检测Danyl-R6G对pH的响应，另外对含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物（简称为R6G-内酰胺）和丹磺酰基团(dansyl)分别在532 nm和300 nm两个波长下进行激发检测二者对pH的响应（图3）。可以看到，当缓冲液pH在5.5至3.5区间变化时，波长在552 nm时激发出最优荧光强度（图3），表明制备的Danyl-R6G通过酸性介导的内酰胺开环而使之产生强烈的荧光。其中，pH4.0时发出的荧光强度比pH 6.5强200倍。相反地，随着缓冲液的pH从7.0降低到3.5,Danyl基团的荧光发射强度有所减弱（激发波长为300 nm)。