[发明专利]一种利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及单链抗体通过在大肠杆菌体内定点糖基化后，利用糖链标签进行以共价键定向固定单链抗体的方法，属于生物技术领域。 

背景技术

单链抗体只保留了全抗体和抗原结合部位，包含全抗体轻链和重链的超变区，以10-30个氨基酸柔链相连，保持和全抗体抗原结合区非常相近的结构，是最小的重组抗体片段，只有全抗体的1/8。和全抗体相比，单链抗体的应用可以提高单位面积固定抗体的数量，大幅提高免疫传感器的敏感性。目前，已有大量应用单链抗体研制免疫传感器及免疫检测研究报道，单链抗体非常有前途代替全抗体进行免疫检测及相关免疫传感器制备。 

在免疫检测领域，限制单链抗体应用的主要技术障碍就是单链抗体固定的问题。由于其分子小，难于稳定固定在固体表面，或固定后部分抗体失去活性。 

目前，固定单链抗体的方法主要是通过基因工程法引入特定标签，通过标签定向固定单链抗体。以非共价键的方式定向固定单链抗体的研究报道很多，如在单链抗体C末端或柔链间引进组氨酸、精氨酸柔链标签或融合能和材料表面特定分子结合的短肽标签，如能与生物素特异结合的链霉素结合蛋白片段、能与链霉素结合蛋白结合的短肽、能与聚苯乙烯特异结合肽或与纤维素结合蛋白等标签。单链抗体通过这些标签和固体材料表面进行离子间的相互吸附或分子间的特异结合，以非共价键形式与固体材料表面特异结合，实现定向固定单链抗体，提高单链抗体被固定后免疫传感器的敏感性。但是，分子间以非共价键的方式结合的牢固程度与以共价键分子间的结合的牢固性相比相差甚远，单链抗体容易脱离固体材料表面。目前，通过共价键定向固定单链抗体的方法主要是通过基因工程法在单链抗体的C末端加上半胱氨酸而引入巯基，从而使单链抗体能与材料表面的特殊基团结合形成共价键来定向固定单链抗体。由于在单链抗体的C末端引入巯基，这很容易使单链抗体在表达过程中或在分离纯化过程中，极易在单链抗体间或与单链抗体自身的巯基间形成二硫键产生二聚体或多聚体，从而影响单链抗体结合抗原活性。 

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，是目前应用最广泛的外源蛋白质表达系统。该系统可以快速、高效和低成本地大量生产外源蛋白，表达 水平一般较真核表达系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5%～30%，且下游工艺简单、易于控制。但是，传统的大肠杆菌表达系统缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统，如无法糖基化修饰外源蛋白质。 

图4为抗荧光素单链抗体4M5.3基因结构表达框图。该4M5.3基因是由抗荧光素单链抗体基因，该基因在2006年Protein Sceince(ISSN:0961-8368)15(2):324-334上有详细描述。图1是抗荧光素单链抗体4M5.3晶体结构。 

现有技术，人们系统地研究了空肠弯曲菌（C.jejuni 81116）糖基化蛋白质途径和在大肠杆菌中糖基化机制。通过空肠弯曲菌（C.jejuni 81116）来源的pgl基因簇编码合成糖链和寡糖转移酶所需的一系列酶基因，在大肠杆菌中与目的单链抗体共表达可实现定点糖基化单链抗体，原理如图2所示；其中，图1和图2中，VL N-term：轻链N末端；VL C-term:轻链C末端；VH N-term：重链N末端；VH C-term：重链C末端；Antigen：抗原分子；Glycan Chain：多糖链。 

目前国内外尚无利用糖基化单链抗体的糖链作为共价定向固定单链抗体标签的报道。 

发明内容

本发明提供一种利用糖链进行以共价键定向固定单链抗体的方法，可广泛应用于利用单链抗体进行免疫检测、免疫传感器制备。 

为了达到上述目的，本发明一种利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法，包括如下步骤： 

S1、在单链抗体基因的5′端，或者3′端，或者是在柔链区引入编码寡糖转移酶识别序列：D/E-X-N-X-S/T；将重组后的单链抗体基因连接到原核质周腔表达载体； 

其中，D代表天冬氨酸，E代表谷氨酸，N代表天冬酰胺，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表天然20中氨基酸中的任意一种氨基酸； 

S2、将所述表达载体转化到含有来源于空肠杆菌由氯霉素抗性标记的pgl基因族工程菌株CLM37，然后，将阳性转化子进行自诱导表达； 

S3、收集菌体，提取质周腔可溶蛋白，分离纯化糖基化单链抗体；