[发明专利]一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过控制发酵条件来生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，属于生物工程领域。

背景技术

普鲁兰多糖（Pullulan）中文亦译为茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖或普鲁兰糖。它是出芽孢梗霉产生的胞外多糖，以α-1,6-糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主，即葡萄糖按α-1，4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α- 1，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子多糖。α-1，4-糖苷键同α-1，6-糖苷键的比例为2：1，聚合度（D.P）为 100－5000，分子量5万－200万。普鲁兰多糖的应用跟其分子量有直接关系，用于食品保鲜成膜的普鲁兰多糖分子量在20万Dal以上，用于胶囊制备的普鲁兰多糖分子量为30万Dal以上，用于食品增稠的普鲁兰多糖分子量在50万Dal以上，故生产高分子量的普鲁兰多糖可以大大拓展普鲁兰多糖应用领域，提高产品附加值。

微生物发酵是普鲁兰多糖主要的生产方法，关于普鲁兰多糖的发酵生产方法也有很多报道。专利97121608.8公开的一种发酵生产普鲁兰的新方法，生产的普鲁兰多糖平均分子量为10万道尔顿；专利200810052070.6公开的一种生产普鲁兰多糖的发酵方法得到分子量20-60 万道尔顿之间的普鲁兰多糖；专利200910148764.4公开了一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，通过调节发酵培养基中有机氮源和无机氮源的浓度能够生产平均分子量在8万-48万之间的普鲁兰多糖。从这些及其他已公开的普鲁兰多糖生产方法的报道中，生产的普鲁兰多糖的分子量都较低，均在60万道尔顿以下，而且分子量分布范围宽，极大限制了普鲁兰多糖的生产和应用。

本发明通过调节培养基中磷酸盐的浓度和初始pH，使发酵液的pH在发酵后期稳定在2.3-3.5之间，控制不同的磷酸盐的浓度和初始pH，可以得到分子量从50万到200万的普鲁兰多糖，提供了一种高分子量普鲁兰多糖的生产方法，而且工艺简单、成本低、效率高。

发明内容

一种高分子量普鲁兰多糖的生产方法，其实施步骤如下：

（1）    种子培养：挑取一环出芽短梗霉孢子到液体种子培养基中，种子培养基组成为蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氢二钾 6.3g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铵0.6g/L，调节pH至6.5，28℃培养24-48h；

（2）    发酵培养：按3%-10%接种量将培养好的种子接种到发酵培养基中培养，发酵培养基的组成为：蔗糖100.0g/L、酵母浸出物 2.0g/L、硫酸铵0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸盐0-0.1mol/L，其中磷酸盐包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等，初始pH 3.5-6.5，培养温度28℃，培养12h后发酵液pH降至2.3-3.5之间，继续培养36-48h后结束发酵；

（3）    发酵液后处理：发酵液经过滤除菌、酒精沉淀、干燥，即可得到白色的普鲁兰多糖产品。

在发酵培养过程中，通过减少磷酸盐的含量和降低发酵液初始pH，从而使发酵后期发酵液pH维持在比较低的条件下，改变细胞合成和分泌普鲁兰多糖的能力，生产高分子量的普鲁兰多糖。

本发明工艺简单，控制容易，周期短，成本低，能够获得各种预期的分子量普鲁兰多糖，满足不同的需求，生产一系列的普鲁兰多糖产品，为高分子量普鲁兰多糖的生产提供了一种新方法，具有极大的工业化潜质。

具体实施方式

   [0008] 以下结合具体实例对本发明技术方案及其使用效果作进一步描述，但不局限于这些实例。

实施例一、

（1）挑取一环出芽短梗霉孢子到液体种子培养基中，种子培养基组成为蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氢二钾 6.3g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铵0.6g/L，调节pH至6.5，28℃培养24h；

（2）配置发酵培养基，组成为蔗糖100.0g/L、酵母浸出物 2.0g/L、硫酸铵0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾0.1mol/L，调节pH至3.5，121℃灭菌20min后，按3%接种量接种种子培养液，28℃培养，12h后培养基pH降至2.4左右并稳定在2.4左右，48h后结束发酵，发酵液粘度为2100mpas；

（3）将发酵液稀释一倍，板框过滤除去菌体，滤液精酒精沉淀、烘干，得到颜色洁白的普鲁兰多糖产品，平均分子量为220万道尔顿。