[发明专利]6条寡核苷酸序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及溶藻弧菌的识别检测，尤其是涉及6条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。

背景技术

在养殖业中，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。

目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体。由于制备技术要求较高、周期较长，因此其应用受到限制。

指数富集配体进化技术（Systemic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment），简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。

SELEX技术的出现为微生物的快速检测提供了新的研究思路，其应用也将越来越广泛。在SELEX筛选中，以灭活菌为靶目标进行筛选，不仅具有较好的安全性，而且使目标菌的形态相对稳定和固定，从而有效提高了筛选的效率和效果。同时，以灭活菌为靶目标，还能有效避免环境因子对活菌的影响，使筛选的稳定性得到较好的改善。因此，开展以灭活菌为靶目标的SELEX筛选，具有重要意义。

溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX技术筛选灭活溶藻弧菌适配子，并将其应用于灭活溶藻弧菌的识别鉴定，能大大提高溶藻弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本发明的重点。

本申请人在中国专利201110090419.7中已公开了4条适配子序列，分别如下：

8号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGTGAACGGAGGG GGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

10号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAAGGACTGTGTC GAGTGTTGGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

37号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTAGGAGGGCCAC AGTGGACTGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

46号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCT GGGGTCTC-3′。

本申请人在中国专利201110259244.8中已公开了3条适配子序列，分别如下：

序列1：5′-GAGACCCCAG  AGGGAAGGAG  GCGGCGAAGC  GACTGGAAGGAGACGGCGAA GCGACTGA-3′；

序列2：5′-TCAGTCGCTT  CGCCGTCTCC  TTCCAGTCGC  TTCGCCGCCTCCTTCCCTCT GGGGTCTCCC TCTTGTGC-3′；

序列3：5′-GCACAAGAGG  GAGACCCCAG  AGGGAAGGAG  GCGGCGAAGCGACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′。

发明内容