[发明专利]一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法。

背景技术

神经干细胞具有自我更新能力以及分化为神经系统各类细胞的能力，在科研与临床上都具有重要意义。神经干细胞为修复受损的神经组织提供了可能途径，但是由于神经干细胞的来源受限，大量获取比较困难。

细胞转分化技术的出现可以将其他谱系的较容易获取的细胞（如成纤维细胞）转分化为神经干细胞。目前转分化主要采取转基因的方法，但是由于基因组的改变，细胞面临癌变的风险，众多科研人员正在致力于寻找更安全的细胞转分化的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法。

本发明提供了一种制备神经干细胞的方法，是将离体的成纤维细胞进行悬浮培养，得到神经干细胞。

所述悬浮培养是在三维悬浮培养基上进行的；所述三维悬浮培养基为在细胞培养液中添加琼脂糖得到的凝胶。

所述细胞培养液可为DMEM培养基，具体可为高糖DMEM培养基。

所述琼脂糖在所述凝胶中的浓度具体可为0.5g/100mL。

所述凝胶的制备方法具体如下：将2倍浓度的所述细胞培养液与琼脂糖溶液混合，得到混合液；所述混合液凝固后得到所述凝胶。

所述琼脂糖溶液具体可为将琼脂糖溶于DPBS缓冲液得到的溶液。

所述成纤维细胞在进行所述悬浮培养前，可先进行胰酶消化。

所述胰酶消化采用的消化液的制备方法具体如下：在100mL DPBS缓冲液中溶解胰蛋白酶干粉0.25g、EDTA-4Na 0.04g，用0.22μm滤膜过滤除菌。

所述成纤维细胞可为小鼠成纤维细胞。所述小鼠成纤维细胞具体可为小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠尾尖成纤维细胞。

所述小鼠具体可为ICR小鼠。

以上任一所述方法制备得到的神经干细胞也属于本发明的保护范围。

以上任一所述神经干细胞为神经干细胞标志物表达量大于所述成纤维细胞的细胞。所述神经干细胞为如下各个标志物中的至少一种：Sox2、Nestin、Pax6、Olig2、Blbp、Nkx2.2、Ascl1、Brn2和Gpm6a。

以上任一所述神经干细胞为具有分化成星形胶质细胞和/或少突胶质细胞和/或神经元的能力的细胞。

所述星形胶质细胞可为表达星形胶质细胞分化标志物GFAP和/或星形胶质细胞分化标志物S100的细胞。

所述少突胶质细胞可为表达少突胶质细胞分化标志物O4的细胞。

所述神经元可为表达神经元分化标志物的细胞。

细胞命运不仅受内部基因的调控，外部环境的影响也是很关键的。神经干细胞在体外一般以神经球的形态生长，本发明通过低贴附的物理方法使小鼠成纤维细胞生长为三维立体球状，从而模拟神经球的形态。实验结果表明通过三维球状培养，小鼠成纤维细胞(胚胎成纤维细胞和尾尖成纤维细胞)可以转分化为神经干细胞样的细胞。

本发明提供的制备神经干细胞的方法，操作简便、成本低廉，对于神经干细胞的制备和应用具有重大价值。

附图说明

图1为实施例1中对细胞形态进行电子显微镜观察并拍照的照片。

图2为实施例1中神经干细胞标志物的定量PCR检测的结果。

图3为实施例1中神经干细胞标志物的免疫荧光染色的结果和诱导分化后分化标志物的免疫荧光染色的结果。

图4为实施例2中神经干细胞标志物的免疫荧光染色的结果和诱导分化后分化标志物的免疫荧光染色的结果。

图5为实施例3中对细胞形态进行电子显微镜观察并拍照的照片。

图6为实施例2中神经干细胞标志物的定量PCR检测的结果。

图7为实施例3中神经干细胞标志物的免疫荧光染色的结果和诱导分化后分化标志物的免疫荧光染色的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中的PBS缓冲液均为购自Hyclone的货号为SH30013.09的pH7.0-7.4的DPBS缓冲液。

胎牛血清:Gibco。高糖DMEM培养基：Gibco。

ICR小鼠：购自维通利华，名称为(ICR)，品系代码为201。