[发明专利]猪细小病毒的培养方法

说明书

 

技术领域

本发明属于猪细小病毒疫苗生产技术领域，具体涉及猪细小病毒的培养方法。

 

背景技术

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）属于细小病毒科，是引起母猪繁殖障碍疾病的主要病原之一，可导致母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。猪是本病唯一的易感动物，不同年龄、性别的家猪和野猪都可感染。带毒猪是PPV的主要传染源，带毒猪的分泌物和排泄物中的病毒可保持感染数月。实验证明，虽然带毒猪的排毒时间只有1 周～2 周, 但被其污染的圈舍至少在4 个月内仍具感染性，这主要是因为PPV 对热稳定，对许多常用的消毒剂具有抵抗力，因此，污染的圈舍是PPV 的主要储藏所。

该病最早是在1967 年发现于英国,Carteright报道了本病，并从猪的流产胎儿中分离到PPV。目前世界各个国家均有流行和报道。我国自20世纪80 年代从各地相继分离到PPV，血清学调查证实猪群中该病的阳性率达85%以上，给养猪业带来巨大的经济损失。目前世界上多采用疫苗免疫来控制本病的流行，在疫苗的生产过程中多使用细胞来增殖病毒，最常用的细胞大多都采用该病毒的本动物细胞（包括猪肾细胞、睾丸细胞和传代系PK-15细胞）和人的某些传代细胞（如Hela、KB等），但由于该病毒在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量和血凝价均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养及培养技术，将难以生产出优质的疫苗。

 

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述缺陷，本发明的目的在于，提供一种猪细小病毒的培养方法，解决现有技术因猪细小病毒在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量和血凝价均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养及培养技术，难以生产出优质疫苗的问题。

本发明提供的猪细小病毒的培养方法，包括以下步骤：

（1）细胞传代，将长满细胞瓶的生长状态良好的ST细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入MEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍；

（2）病毒增殖，将PPV毒种2 %同步接种ST细胞，并同时设未接毒的正常对照细胞，置37 ℃、5 % CO₂ 培养箱培养，接毒后16h换用不含血清的MEM细胞培养液，每天观察细胞病变CPE并记录病变情况，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，1 500 r·min^-1离心l5 min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3 次， -70 ℃冰柜保存备用；

它还包括以下步骤：TCID₅₀的测定，将所述步骤（2）中增殖后的第3代PPV病毒液用含10 %血清的MEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10^-4～10^-7 4个稀释度同步接种每孔100μL ST细胞悬液的96孔微量培养板各8孔，每孔100μL，接毒后16 h换成不含血清的MEM培养液，同时设细胞对照孔，置37 ℃、5 % CO₂培养箱培养，观察6 d，按Reed-Muench法计算TCID₅₀；它还包括以下步骤：血凝价的测定，（1）红细胞的制备，无菌采取豚鼠血液，按1：9的比例加入PH7.2的PBS，混匀，2 000 r·min^-1离心10 min，吸去上清和中层的白细胞，加入红细胞体积10倍的PBS，混匀离心10 min，然后重复以上操作3次，最后将红细胞转至另一无菌的离心管中，同时用PH7.2的PBS稀释成浓度为0.6 %的豚鼠红细胞，4 ℃保存备用；

（2）血凝试验将所述步骤（2）中增殖后的第3代PPV病毒液作为待测病毒分别测定血凝价，采用标准U型板，首先加入25μL PBS，然后将待测病毒做1：2，1：4…1：4096做倍比稀释，在96孔U型板中每孔加入25μL稀释好的病毒液，再加入25μL 0.6 %的红细胞，轻轻振荡混匀，室温感作2～3 h，判定结果。