[发明专利]猪细小病毒的培养方法

权利要求书

1.一种猪细小病毒的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）    细胞传代，将长满细胞瓶的生长状态良好的ST细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入MEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍；

（2）    病毒增殖，将PPV毒种2 %同步接种ST细胞，并同时设未接毒的正常对照细胞，置37 ℃、5 % CO2 培养箱培养，接毒后16h换用不含血清的MEM细胞培养液，每天观察细胞病变CPE并记录病变情况，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，1 500 r·min-1离心l5 min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3 次， -70 ℃冰柜保存备用。

2.根据权利要求1所述的猪细小病毒的培养方法，其特征在于：它还包括以下步骤：

TCID50的测定，将所述步骤（2）中增殖后的第3代PPV病毒液用含10 %血清的MEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10-4～10-7 4个稀释度同步接种每孔100μL ST细胞悬液的96孔微量培养板各8孔，每孔100μL，接毒后16 h换成不含血清的MEM培养液，同时设细胞对照孔，置37 ℃、5 % CO2培养箱培养，观察6 d，按Reed-Muench法计算TCID50。

3.根据权利要求1所述的猪细小病毒的培养方法，其特征在于：它还包括以下步骤：

血凝价的测定：（1）红细胞的制备，无菌采取豚鼠血液，按1：9的比例加入PH7.2的PBS，混匀，2 000 r·min-1离心10 min，吸去上清和中层的白细胞，加入红细胞体积10倍的PBS，混匀离心10 min，然后重复以上操作3次，最后将红细胞转至另一无菌的离心管中，同时用PH7.2的PBS稀释成浓度为0.6 %的豚鼠红细胞，4 ℃保存备用；

（2）    血凝试验，将所述步骤（2）中增殖后的第3代PPV病毒液作为待测病毒分别测定血凝价，采用标准U型板，首先加入25μL PBS，然后将待测病毒做1：2，1：4…1：4096做倍比稀释，在96孔U型板中每孔加入25μL稀释好的病毒液，再加入25μL 0.6 %的红细胞，轻轻振荡混匀，室温感作2～3 h，判定结果。