[发明专利]一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括：

第一试剂：含荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；

第二试剂：含碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；

磁分离剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

2.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体由碱性磷酸酶与肿瘤相关抗原CA125抗体通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和2-亚氨基硫烷盐酸盐连接构成。

3.根据权利要求1或2所述的肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述第一试剂中的荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的浓度为0.5~1μg/mL，所述第一试剂的pH为7-9；所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的浓度为0.5~1μg/mL，所述第二试剂的pH为7-9。

4.一种如权利要求3所述的肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于：所述含有碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液的制备过程如下：

① 将肿瘤相关抗原CA125抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体，于2~8℃下保存备用；

② 将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于2~8℃下保存备用；

③将上述步骤①所得活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体，反应结束后，将反应液用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；

其中，所述的肿瘤相关抗原CA125抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤①中，取肿瘤相关抗原CA125抗体，加入偶联剂2-IT溶液溶解，室温静置10min~30min，加入甘氨酸溶液，室温静置2~10min，用G-25凝胶纯化柱除盐，收集活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体，于2-8℃保存备用。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤②中，取浓度大于等于5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置20~40min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，于2-8℃保存备用。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述第一试剂的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为9~10的缓冲液，然后按照荧光素与肿瘤相关抗原CA125抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9~10的缓冲液与肿瘤相关抗原CA125抗体的pH为9~10的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液，接着用具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得第一试剂。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述磁分离剂的制备方法如下：使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下，室温反应2~18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述的磁分离剂；其中所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2μm，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量大于等于0.4mmol；所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万。

9.根据权利要求4或7或8所述的制备方法，其特征在于：所述的具有适当pH值的缓冲液为含有0.5%牛血清白蛋白、pH8.0的TRIS缓冲液。

10.采用权利要求1~3中任一项权利要求所述的试剂盒用于对肿瘤相关抗原CA125定量检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）免疫反应：在检测管中加入待测样本原液，依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在25~40℃下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，在25~40℃下进行第二次温育；

（2）洗涤：使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后磁分离，去除上清；

（3）加底物溶液检测发光强度：在检测管中加入碱性磷酸酶催化的化学发光底物，去除磁场，充分混悬后检测发光强度值。