[发明专利]一种富集和无分化扩增悬浮干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种富集和无分化扩增悬浮干细胞的方法。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的一种重要疾病，是目前人类疾病死亡的第二杀手。白血病是人体循环系统的肿瘤，近年来该疾病的发生呈显著的增长态势，并呈现低龄化的趋势。人们对白血病的治疗，主要通过化疗的方法。虽然骨髓抑制被认为是治疗白血病和淋巴瘤的有效手段，但是由于血液配型等异体抑制排斥作用的存在，严重限制了骨髓移植技术的广泛应用。化疗技术虽然能够显著抑制白血病和淋巴瘤的增殖，能够彻底治愈的仍不普遍。大约50年前，人们最早从髓性白血病的发生和演变规律中提出了肿瘤干细胞的概念，并认为这些肿瘤干细胞是正常干细胞和/或祖细胞通过突变形成的。正常造血干细胞能够持续分化成造血细胞，如红细胞、血小板、白细胞（包括T-淋巴细胞和B-淋巴细胞）、中性粒性细胞等。肿瘤干细胞与正常干细胞具有相似的性质，也能分化、增殖成具有基因缺陷的造血细胞系或未成熟的祖细胞，又称胚细胞。人们发现并验证肿瘤干细胞在肿瘤的发生、发展与恶化过程中的作用首先是从急性髓性白血病病人样品中分离出一种具有表面抗原CD96阳性的肿瘤细胞亚型2，这种肿瘤干细胞在肿瘤中的数目极少，但肿瘤的恶性很强，是肿瘤的化疗耐药的重要原因之一，也是白血病化疗失败的重要根源。因此，寻找新的、高效低毒、对肿瘤干细胞专一的新的肿瘤治疗方法和新的药物筛选模型是彻底治愈肿瘤疾患的一个主要技术瓶径。

目前从临床血液样品，骨髓或白血病细胞系分离悬浮肿瘤干细胞仍然是一件非常困难的事，主要原因是由于血液肿瘤干细胞的数目非常少。已经被广泛采用的分离方法有两种，（1）通过标记肿瘤干细胞的特征表面抗原，采用流式细胞分选技术或免疫磁珠分选出富含肿瘤干细胞的组分。目前所使用的表面特征抗原主要有CD9,CD33,CD44,CD90,CD96,CD110,CD123等。由于采用单一表面抗原对肿瘤干细胞的区分能力具有局限性，用该法分选出的肿瘤干细胞数量少，分离过程中细胞受损伤以及干细胞的纯度不够高，是限制深入研究肿瘤干细胞的一个技术屏障。（2）研究肿瘤干细胞的另一种分选策略是通过细胞流式分选技术将血液肿瘤中的能排出荧光染料，如荧光染料Hoechst 33342,的细胞，称为侧群细胞。由于侧群细胞只是相对富集了肿瘤干细胞，通过研究肿瘤侧群细胞的性质并不能全面反映肿瘤干细胞的性质。

发明内容

本发明提出一种富集和无分化扩增悬浮干细胞的方法，解决了现有技术中肿瘤干细胞无法高效低毒的实现富集和无分化扩增的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种富集和无分化扩增悬浮干细胞的方法，在血液肿瘤细胞的集落培养中，向胚胎干细胞培养基中加入Delta-like 4，Jagged 1和FGF2成分因子为培养基主要组分，并向所述胚胎干细胞培养基中加入抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，进行半固体培养，血液肿瘤干细胞可以形成集落。

作为优选的技术方案，所述抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂为CHIR99021、PD173074、PD184352或PD0325901，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率，避免使用昂贵的流式细胞仪的分选和富集，从而降低悬浮干细胞的富集成本。

作为优选的技术方法，向所述胚胎干细胞培养基中添加占所述胚胎干细胞培养基体积30-100%的基础培养基。

作为优选的技术方案，所述基础培养基为DMEM或RPMI 1640。

作为优选的技术方案，所述扩增悬浮干细胞的培养基按体积比包括30-100%的DMEM基础培养基和0-70%的胚胎干细胞培养基HEScGRO。

作为对上述技术方案的改进，所述扩增悬浮干细胞的培养基还含有0-2μg/ml的DII4、0-1μg/ml的FGF2、0-2μg/ml的Jag1、0-1μg/ml的SCF、0-1μg/ml的LIF、0-1μg/ml的TGF-β、0-1μg/ml的TPO、0-300nM的CHIR99021、0-1μM的PD173074、0-1μM的PD184352和0-1μM的PD0325901。

由于采用了上述技术方案，一种富集和无分化扩增悬浮干细胞的方法，在血液肿瘤干细胞的集落培养中，向胚胎干细胞培养基中加入Delta-like 4，Jagged 1和FGF2成分因子为培养基主要组分，并向所述胚胎干细胞培养基中加入抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，进行半固体培养，血液肿瘤干细胞可以形成集落，解决了现有技术中肿瘤干细胞无法高效低毒的实现富集和无分化扩增的问题。