[发明专利]一种鸟粪石体外模型的构建方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种鸟粪石体外模型的构建方法，属于医学领域。

背景技术

鸟粪石是由解脲酶微生物所引起的人类常见肾结石之一。主要由六水磷酸铵镁/碳酸磷灰石所组成。为了预防鸟粪石的生成和复发以及研究如何溶解鸟粪石，必需建立鸟粪石的体外模型。我国目前尚无鸟粪石体外模型建立的研究。构建有效的鸟粪石体外模型有利于在体外观察鸟粪石形成的物理过程，以及在体外进行化学溶石的研究。

发明内容

本发明为了解决现有技术的上述不足，提供了一种鸟粪石体外模型的构建方法。

本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现：

本发明是使用Griffith法配制了人工尿液，将稀释后的奇异变形杆菌液接种于人工尿液中，奇异变形杆菌产生的解脲酶将人工尿中的尿素分解为氨和CO₂，氨水可增加尿pH值，铵与尿中的镁和磷酸根结合成磷酸铵镁呈高度过饱和而析出，同时，在碱性尿液中，钙和磷酸根合成磷灰石，并与来自尿素的二氧化碳结合成碳酸磷灰石，当这些成石物质达到过饱和时，结晶也将迅速形成，由此可以设计建立实验结石模型。前述结晶形成的两项核心技术是人工尿液的温度和菌液的浓度。结晶经过红外光谱分析，确认为碳酸磷灰石与磷酸铵镁的混合性结晶即鸟粪石。

一种鸟粪石体外模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、取100ml无菌玻璃试管，在超净工作台将人工尿液80ml转移至试管；

B、将0.5麦氏浊度菌液0.8ml加入人工尿液，38—42℃孵育；

C、于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小时分别取5ml试管内液体，取其中100ul液体，点于96孔板内，并以显微镜观察摄片；

D、其余以紫外分光光度计检测OD600吸光度，记录读数；

E、检测完的人工尿液2000rpm 10min低速离心,取上清检测pH值，记录读数；

F、24小时后离心收集晶体，0.05M pH8.6 Tris-HCl洗3遍，干燥后以红外光谱及及偏振光显微镜分析。

所述人工尿液，以g/L计，各成分含量如下：CaCl2·2H2O，0.651； MgCl2·6H2O，0.651；NaCl，4.6；Na2SO4，2.3；KH2PO4，2.8；KCl，1.6；NH4Cl 1.0；Urea，25.0；Creatine，1.1；肉汤培养基，10.0。

所述0.5麦氏浊度菌液的制备方法，包括以下步骤：

A、从孵育了18-24小时的琼脂平板上挑出单个菌落，用盐水制成悬液；

B、在光线充足的地方，背对着有白色背景与黑色对比线条的卡片，将接种管与0.5号麦氏标准管进行目测比较，将菌悬液调至0.5麦氏浊度。

所述0.5号麦氏标准管的制备方法为：将0.117g氯化钡溶于10mlddH2O，浓度为0.048M，1ml浓硫酸加入99mlddH2O得0.18M硫酸；取0.5ml 0.048M氯化钡加99.5ml0.18M硫酸制得0.5麦氏比浊管，约相当于1～2×108CFU/ml。

本发明与现有技术相比的优点是：采用本发明的构建方法，鸟粪石体外模型的结晶形成率高，有利于在体外观察鸟粪石形成的物理过程，以及在体外进行化学溶石的研究。

 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步详述：

1、实验材料

1.1试剂

Mueller-Hinton （M-H）肉汤培养基，Mueller-Hinton （M-H）琼脂培养基,氯化钙、氯化镁、氯化钠、硫酸钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化铵、尿素及肌酸均为普通分析纯试剂。 

1.2 菌种

奇异变形杆菌。

1.3 仪器

电子分析天平；紫外分光光度计；酸度计；酶标仪；超净工作台；恒温培养箱；倒置显微镜；低温超速离心机；傅里叶变换式红外光谱分析仪（天津LIIR）；偏振显微镜。

2、实验方法

2.1 人工尿液制备

Griffith法配制人工尿液，各成分含量（g/L）如下：CaCl2·2H2O，0.651； MgCl2·6H2O，0.651；NaCl，4.6；Na2SO4，2.3；KH2PO4，2.8；KCl，1.6；NH4Cl 1.0；Urea，25.0；Creatine，1.1；肉汤培养基，10.0，调节pH至5.8。于超净工作台内0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。