[发明专利]黄柏药材双溶剂融合HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

权利要求书

1.黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：配制盐酸小檗碱对照品溶液；

(2)制备供试品溶液：称取黄柏或关黄柏药材用两种不同溶剂进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱；紫外检测波长：300nm检测；在相同色谱条件下，对同一样品的不同提取物测定色谱图，对色谱图进行融合，得到融合指纹图谱；

(4)评价相似度：将分析所得的双溶剂融合指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。

2.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(1)中所述盐酸小檗碱对照品溶液的浓度为20～500μg/mL。

3.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述药材的称重量为0.1～10g。

4.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述两种不同溶剂为甲醇和甲醇-盐酸、乙腈和乙腈-盐酸、或甲醇和甲醇-醋酸。

5.根据权利要求4所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述甲醇-盐酸中甲醇和盐酸的体积比为100∶1，乙腈-盐酸中乙腈和盐酸的体积比为100∶1，甲醇-醋酸中甲醇和醋酸的体积比为100∶1。

6.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述提取步骤为采用甲醇和甲醇-盐酸提取；再采用超声提取，提取时间为10～60min。

7.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述黄柏药材产自四川，所述关黄柏产自辽宁。

8.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(3)中所述微孔滤膜孔径为0.2μm～0.8μm。

9.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(3)中所述梯度洗脱的流动相为甲酸-甲酸铵缓冲液(A)和乙腈(B)梯度洗脱；梯度洗脱时间为20～60min，流速0.3～2.0ml/min；柱温20～45℃。

10.如权利要求9所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(3)中所述梯度洗脱的洗脱程序以如程序进行：乙腈0～13min，13％～15％B(体积比)；13～22min，15％～35％B(体积比)；22～27min，35％～42％B(体积比)；27～27.1min，42％～13％B(体积比)；27.1～37min，13％B(体积比)。

11.如权利要求9所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述甲酸-甲酸铵缓冲液包含20mmol/L甲酸铵，pH为3.09-3.13。

12.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(3)所述测定中，高效液相色谱仪自动进样器进样0.5～20μl。

13.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(4)所述评价相似度中，供试品指纹图谱在300nm检测波长下的相似度均大于0.90。

14.根据权利要求1-13任一项所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法所测得的黄柏药材标准指纹图谱，其特征在于：所述指纹图谱中有8个共有峰，编号依次为1～8，非共有峰面积占总色谱峰积面积比值＜10％。共有峰的峰号(相对保留时间)为：1(0.263)，2(0.305)，3(0.515)，4(0.694)，5(0.718)，6(0.793)，7(0.847)，8(1.000)；共有峰的归属为：峰8为盐酸小檗碱。

15.根据权利要求14所述的黄柏药材HPLC指纹图谱，其特征在于：所述8个共有峰中，单峰面积占总峰面积大于5％，而小于10％的共有峰为峰5；单峰面积占总峰面积大于10％的共有峰为峰3、峰7、峰8；其余色谱峰峰面积均小于5％。