[发明专利]一种重组蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组抗病毒蛋白RC28的制备方法。

背景技术

病毒性疾病在人与动物传染病中约占60％，严重危害生命健康，因而抗病毒药物研究受到广泛关注，成为国际研究开发热点之一。单纯疱疹病毒（HSV）属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米，根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。该病毒感染是人类的一种常见传染病，其感染部位广泛，常发于癌症或其他慢性病应用各种免疫抑制剂的病人中。现已正式，HSV感染与先天畸形、流产、宫颈癌、脑炎、新生儿疾病、性病等10多种疾病有关。目前国内外研究的抗病毒药物较多，但过度到临床治疗全身性感染的药物有限，且已被发现有耐药株。

单疱病毒性角膜炎（herpes simplex kerratitis,HSK）是单纯疱疹病毒I型感染眼部引起，该病毒是一种常感染人的DNA病毒，在人群的感染很普遍，感染率高达90%以上，是目前的致盲眼病之一。抗单疱病毒性角膜炎的药物主要有核苷类药物和非核苷类药物。目前抗HSV-1药物存在药物作用机制相似、疗效不稳定、毒副作用较大及易于产生交叉耐药性等问题，因此寻找新的抗病毒药物是国际研究开发热点之一。

专利号：ZL200910137386.X，发明名称：“一种抗病毒蛋白及其制备方法和应用”的专利公开了一种抗病毒蛋白RC28，抗病毒蛋白RC28是从天然皱盖罗鳞伞中分离纯化的，具有较强的抗HSV-1病毒效果。但是，皱盖罗鳞伞生长条件严苛，四川阿坝州高海拔山区为国内仅有的少数产地之一，采集受季节限制，产量不稳定，难以满足临床需求，分离纯化的成本也很高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用基因工程的方法重组表达抗病毒蛋白RC28的方法，为了实现重组表达，提供了一种新的核苷酸序列，以及含有该序列的重组载体和重组菌。

本发明提供的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明重组载体包括SEQ ID NO.1或所示的核苷酸序列。优选地，所述重组载体是pET26b(+)重组载体。

本发明重组菌，它包括前述的重组载体。优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌。

本发明制备重组蛋白的方法，它包括如下步骤：

（1）取前述的重组菌，在大肠杆菌培养基中培养，诱导表达，得菌液，离心，得菌体；

（2）取步骤（1）所得菌体，裂解，离心，得上清和沉淀，复活沉淀，与上清合并，分离纯化，即得。

其中，步骤（1）所述培养是在含有40~60mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中振摇培养，培养温度为37℃。

其中，步骤（1）所述诱导表达使用的诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.1~1mM，诱导温度为16~37℃，诱导时间为6~18h。优选地，所述步骤（1）中，诱导剂的浓度为1mM，诱导时间为18℃，诱导时间为18h。

其中，步骤（2）所述分离纯化采用Ni亲和层析柱。

本发明还提供了前述方法制备的重组蛋白及其在在制备抗病毒药物中的用途。优选地，所述抗病毒药物为抗单纯疱疹病毒的药物。进一步优选地，所述抗病毒药物为治疗单疱病毒性角膜炎的药物。

本发明用基因工程的方法制备得到了重组抗病毒蛋白RC28，该蛋白抗病毒活性高，单疱病毒性角膜炎的疗效确切，为临床抗病毒药物提供了一种新的选择，具有良好的工业应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1重组表达载体酶切结果。1：重组载体；2：NdeI/XhoI双酶切重组载体得到的载体和本发明重组蛋白（714bp）；3：分子量Marker。

图2本发明重组蛋白的诱导表达结果。1：诱导前总蛋白；2-5：不同的单克隆IPTG诱导后总蛋白表达谱。

图3本发明重组蛋白的可溶性鉴定结果。1、3、5、7：诱导后超声破碎上清；2、4、6、8：诱导后超声破碎沉淀。

图4本发明重组蛋白全自动层析系统结果图。