[发明专利]紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于植物生化检测技术领域，具体地，涉及一种紫花苜蓿(Medicago sativa L.)叶黄素循环组分的快速检测方法。

背景技术：

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是我国栽培历史最久、分布最广、种植最多的优良豆科牧草。紫花苜蓿具有产量高、品质好、蛋白质含量高、适口性好等特点，被誉为“牧草之王”。同时，它能保持水土、培肥地力、增加饲料，对改善农牧业生态环境、促进畜牧业发展有重要作用。由于种植条件粗放，紫花苜蓿经常受到强光、干旱和土壤贫瘠等逆境的胁迫而发生光抑制甚至光破坏，使其光合效率降低、品质下降。环境胁迫如高温、干旱、强光和贫瘠等条件下，植物的光合能力下降，积累的过剩光能易导致光破坏，依赖于植物体内的叶黄素循环耗散过剩激发能，是光合器官在自然条件下免遭光破坏的重要途径之一。叶黄素循环组分由玉米黄质（Z）、环氧玉米黄质（A）和紫黄质（V）构成。当光合器官吸收的光能不能全部被光合作用利用时，V在紫黄素脱环氧化酶催化下。经中间体A脱环氧生成Z，在没有过剩光能条件下，Z在环氧化酶催化下经中间体A加环氧生成V。且Z随着过剩光能的增加而增加，并直接参与热耗散而将多余的激发能猝灭，起到光保护作用。因此，建立紫花苜蓿叶黄素循环组分的测定方法是十分必要的。目前对植物叶黄素循环组分的测定大多数采用的是Spherisorb C₁₈色谱柱柱，使用的流动相是Tris-HCL缓冲液、甲醇和乙酸乙酯。该流动相要么形成不溶于水的晶体沉淀而堵塞管路系统，导致柱压急剧升高，大大缩短了柱的有效使用寿命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要经常洗脱，不仅费时费力，且经常使得被测组分的峰形被破坏。所以建立对色谱柱无伤害、灵敏准确的紫花苜蓿叶黄素组分循环测定方法具有十分重要的作用。

发明目的：

针对现有技术存在的上述不足，本发明旨在提供一种紫花苜蓿叶黄素循环组分的快速检测技术，采用价格较Spherisorb C₁₈相对便宜的Hypersil ODS色谱柱，采用对色谱柱无伤害的常用试剂乙腈作为流动相，为紫花苜蓿叶黄素循环组分的快速、准确检测提供了节约人力、物力和财力的方法。从色素的提取到检测全过程只需1小时即可完成，该方法快速、灵敏、准确。

本发明的上述目的是通过下述的技术方案加以实现的：

紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，取紫花苜蓿鲜叶0.1g,倒入液氮研磨至粉末状，加入85%丙酮，匀浆2-3 min，再加入100%丙酮，匀浆1 min之后置于冰上15 min，1200g离心10 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样到高效液相色谱仪采用浓度线性梯度洗脱，从而检测紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质（Z）、环氧玉米黄质（A）和紫黄质（V）的含量。

所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述高效液相色谱仪使用美国Agilent 1100高效液相色谱仪，色谱柱使用美国Agilent Hypersil ODS的4.0×250 mm，5 μm色谱柱。

所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述浓度线性梯度洗脱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，浓度线性梯度洗脱程序为90% A液 + 10% B液洗脱15min，接着在5min内，90% A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min，流速1 ml/min，检测波长445 nm，柱子温度30℃，进样体积10 μl。

所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，所述紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质0119、环氧玉米黄质0231和紫黄质0259标样购自瑞士carotenature原装，纯度分别为99.6%、95.7%和98.6%。

所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述紫花苜蓿叶黄素提取过程在无光条件下进行。

所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述试剂丙酮为分析纯，水为超纯水，乙腈为色谱纯。