[发明专利]一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种花菁类染料荧光探针、其合成方法及其在检测细胞内硫化氢的应用，属于检测技术领域。 

背景技术：

长久以来，硫化氢(hydrogen sulfide，H₂S)这一具有臭鸡蛋气味的气体，多年来，人们一直认为H₂S仅是一种有毒气体，人们对于它的研究仅限于其毒性作用。20世纪90年代中期，人们发现机体可以内源性产生H₂S气体，它在体内主要由胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ一裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)，催化L-半胱氨酸产生H₂S。CSE基因在主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉中均有表达，而CBS基因主要表达于中枢神经系统中。H₂S具有调节神经、心血管和消化系统功能的作用，参与肺动脉高压、动脉硬化、内毒素休克、出血性休克及心肌缺血性受损等的病理生理过程，被认为是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的一种新的气体信号分子。内源性气体信号分子因其具有持续产生、传播迅速等特点。目前的硫化氢检测技术，如比色法，电化学法，气相色谱法，和金属诱导的硫化物沉淀，往往需要延后处理或破坏的组织或产生细胞裂解物。 

近年用于检测体内硫化氢的荧光探针，比较少见。如荧光素为母体(Hanjing Peng,YunfengCheng,Chaofeng Dai,Adrienne L.King,Benjamin L.Predmore,David J.Lefer,and Binghe Wang,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9672-9675)的探针，选择性好，检测前后荧光增强到原来的55-70倍，但是此探针反应时间长（1h），激发波长在可见光区（488nm）；以BODOPY为母体和(Yong Qian,Jason Karpus,Omer Kabil,Shu-Yu Zhang,Hai-Liang Zhu,Ruma Banerjee,JingZhao,Chuan He,Nature Communications.2011,2,495）以罗丹明为母体的（AlexanderR.Lippert,Elizabeth J.New，and Christopher J.Chang，J.Am.Chem.Soc.,2011,133:10078-10080）荧光探针，虽然选择性好，但是反应时间长（20min或1h）；部分检测硫化氢的荧光探针因为波长短，溶解性差等因素不能用于活体内，如(Hanjing Peng,Yunfeng Cheng,Chaofeng Dai,Adrienne L.King,Benjamin L.Predmore,David J.Lefer,and Binghe Wang,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9672-9675)，此探针虽是个快速反应，但是所选的丹酰为母体，激发为340nm，波长短，如果用于活体会造成损伤。总的来说以上荧光探针一般水溶性不好，而且激发发射波长多处于紫外可见光区，从而限制了它们在生物体内的应用。这就需要研制一种荧光波长长的，水溶性好的荧光探针。而花菁类荧光探针发射波长在近红外区，不易被生物介质基质吸收，对组织损伤小且穿透力强，能很好的用于活体。 

发明内容：

本发明的目的在于克服目前硫化氢检测荧光探针的不足，提供一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用，该类荧光探针结构新颖、灵敏度、选择性好、光稳定性好。 

本发明采取的技术方案为： 

一种检测细胞内硫化氢的荧光探针，其结构式如下： 

所述的检测细胞内硫化氢的荧光探针的制备方法，包括步骤如下： 

（1）将Cy7荧光染料即2-[4-氯-7-（1-乙基-3（二氢吲哚-2-亚基）-2,3-二甲基]-3,5-（丙烷-1,3-二基）-1,3,5-庚三烯-1-基）-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓、乙酸钠溶解在无水DMF中，在Ar气保护下加热回流2-4h，得到的混合物冷却后抽滤，母液低温（-4～20℃）结晶，抽滤得酮式花菁红棕色晶体； 

（2）将邻甲酰基苯甲酸、草酰氯溶解在无水CH₂Cl₂中然后加入少量DMF，在0℃搅拌2-6h，得邻甲酰基苯甲酰氯；