[发明专利]一种毛柄金钱菌菌株及制备方法

说明书

技术领域

本发明属微生物技术领域，具体涉及毛柄金钱菌菌株KML-19及制备方法。 

背景技术

毛柄金钱菌Flammulina velutipes别名又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等，属伞菌目白蘑科金针菇属。毛柄金钱菌营养丰富，清香扑鼻。其菌盖小巧细腻，黄褐色或淡黄色或白嫩。不仅味道鲜美，而且营养丰富，是拌凉菜和火锅食品的原料之一 

在毛柄金钱菌栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。毛柄金钱菌菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于毛柄金钱菌的栽培或菌丝体生产。现有技术的不足在于其生物学特性目前仍处于试验研究阶段，生物转化率较低，而且还要用熟料栽培，生产工艺及技术要素要求较高，因而制约了毛柄金钱菌商品经济的发展。另外只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为毛柄金钱菌纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行毛柄金钱菌资源的保护应用不广泛。

发明内容

本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地毛柄金钱菌子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备毛柄金钱菌液体及固体优良菌种，为毛柄金钱菌资源保护提供优良菌种 

本发明采用的真菌是毛柄金钱菌Flammulina velutipes KML-19；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年10月11日；保藏登记入册的编号CGMCC No.6704

毛柄金钱菌的子实体由菌盖、菌褶、菌柄三部分组成，多数成束生长，肉质柔软有弹性。菌盖呈球形或呈扁半球形，直径1.5～7厘米，幼时球形，逐渐平展，过分成熟时边缘皱折向上翻卷。菌盖表面有胶质薄层，湿时有粘性，色黄白到黄褐，菌肉白色，中央厚，边缘薄，菌褶白色或象牙色，较稀疏，长短不一，与菌柄离生或弯生。菌柄中央生，中空圆柱状，稍弯曲，长3.5～15厘米，直径0.3～1.5厘米，菌柄基部相连，上部呈肉质，下部为革质，表面密生黑褐色短绒毛，担孢子生于菌褶子实层上，孢子圆柱形，无色

本发明的技术方案：

①   采集野生毛柄金钱菌子实体；

②   组织分离或孢子分离；

③   纯化菌株及菌株鉴定；

④   生物学特性比较及生产性状比较；

⑤   确定优良菌株；

⑥   菌种生产及菌种应用； 

经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的毛柄金钱菌液体菌种专用菌株KML-19

本发明真菌Flammulina velutipes培养方法(以下为重量百分比):

菌种分离纯化培养基：2%毛柄金钱菌下脚料、0.001%VB1、2%葡萄糖、2%琼脂；

毛柄金钱菌菌株分离及鉴定方法：

1、将毛柄金钱菌子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24℃下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种

2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24℃下培养5-7天，获得毛柄金钱菌纯化试管种

3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulina velutipes) Identities=518/532(97%)，Gaps=8/532(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体

本发明毛柄金钱菌菌种的制备方法分为：液体培养和固体培养两种

液体菌种制备方法：

液体培养基配方为：10~20%麸皮、10~20%土豆、0.5~1%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然

1、将毛柄金钱菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种

2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天