[发明专利]间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系建立及肿瘤微环境中间充质干细胞遗传稳定性变化特征

说明书

技术领域

本发明涉及间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系及其制备方法和应用；肿瘤微环境中间充质干细胞遗传稳定性变化特征。

背景技术

由于间充质干细胞(marrow mesenchymalstem cell, MSC)尤其是骨髓间充质干细胞（MSC）易于体外分离、扩增，具有良好的多向分化潜能，能提高组织再生修复能力，导入外源基因，肿瘤趋向性和低免疫源性等优良特征而被认为是可用于临床细胞学治疗的最佳干细胞之一。在骨科、心脏病学、血管外科、肿瘤治疗等领域都取得了显著性进展，同时也已成为理想克隆载体转染治疗基因，靶向性治疗肿瘤等。但近期研究表明，干细胞生存的微环境成分及信号通路的改变可能会导致正常的干细胞（包括MSCs）向恶性肿瘤细胞转化，并且对多种肿瘤的发生发展具有促进作用。因而MSCs在临床应用中的安全性问题日渐突出。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了快速建立的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，是采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室结合6孔板进行非接触共培养，取对数生长期的细胞用0.25﹪胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞密度后接种，其中，3天：间充质干细胞5×10⁴ /孔，A549 1×10⁵ /孔；7天：间充质干细胞2×10⁴ /孔，A549 4×10⁴ /孔。

进一步的，上述的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；所述肿瘤细胞为人体肺腺癌上皮细胞系A549细胞。

    本发明的第二个目的是提供了上述间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系的建立方法，是将人体肺腺癌上皮细胞系A549细胞接种于Transwell悬挂式培养小室的下室，将Transwell悬挂式培养小室的上室置于孔中，在Transwell悬挂式培养小室内接种间充质干细胞，然后将Transwell悬挂式培养小室的上下室的培养液相互通融，得到间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系。

进一步的，上述的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系的建立方法，所述共培养体系的培养时间为3天、7天，37℃、饱和湿度、5%CO₂孵箱培养。

本发明的第三个目的是提供了上述间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系在研究肿瘤微环境中间充质干细胞生物学性状变化研究能干的应用以及筛选可提高肿瘤微环境中间充质干细胞遗传稳定性中的应用。

进一步的，上述的应用，所述肿瘤微环境中间充质干细胞可发生遗传稳定性变化，提示肺腺癌微环境引起间充质干细胞细胞增殖能力、迁移能力及遗传稳定性发生了变化，出现向类肿瘤细胞方向转化。

进一步的，上述的应用，所述肿瘤细胞微环境的间充质干细胞发生形态学改变，胞核大而深染，可见病理性核分裂象，与原间充质干细胞存在明显差异；染色体核型分析显示，肿瘤细胞微环境的间充质干细胞染色体数目为亚三倍体、三倍体，有明显的染色体异常。

进一步的，上述的应用，所述肿瘤细胞微环境的间充质干细胞，其细胞克隆形成率明显增多，细胞迁移能力明显改变；激光共聚焦结果显示，间充质干细胞细胞微丝呈束状或放射状聚集在细胞的突起和胞质内；共培养组细胞微丝走行不规则，与A549细胞相似，镜下可见丝足，Western blot结果显示，肿瘤细胞微环境的MSC p53、p62、Bcl-2、Bax、capase-3、HDAC4、MMP-2、MMP-9 HDAC4表达量较原MSC高表达。

本发明的有益效果为：本发明提供的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，能够观察了肿瘤微环境对MSC遗传稳定性的影响，将为进一步深入探讨肿瘤微环境中MSCs生物学性状变化及其临床应用提供技术支撑及其研究依据。