[发明专利]一种生产降解木质素酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白的方法。具体是应用微生物工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶。

背景技术

木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase，LiP)，猛过氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。

植物资源不断再生，十分丰富。植物的基本成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有用的成分是纤维素，次之是半纤维素。前者基本成分是葡萄糖，而后者的基本成分是戊糖。这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。木质素是一种广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物。它形成纤维支架，具有强化木质纤维的作用。纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。要利用纤维素，必须先将木质素水解。木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶具有共同水解木质素的功能。木质素降解酶不仅应用于植物原料的生产乙醇和生产沼气行业，还广泛应用于造纸行业和环境保护等行业。有些天然的微生物具有表达木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶的能力，目前工业生产上是以天然的产菌株进行发酵生产这三种酶。但是，由于天然的产酶菌株的生长缓慢或(和)营养要求高，使生产成本较高。当前有研究用工程菌分别生产这三种酶，由于是分别用一个菌株生产其中的一种酶，那么生产三种酶则需要三道工序，使其生产成本过高。

毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于在厌氧或需氧环境。

发明内容

本发明构建含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌；分别用含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆基因：从天然的产木质素过氧化物酶、产猛过氧化物酶、产漆酶的天然菌株中克隆过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶基因。

2.获得构建表达载体的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因序列。

3.分别构建含这三种基因表达框架(基因表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止子)的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体。载体上的启动子是磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。载体上其它元件还有G418抗性基因和氨苄青霉素抗性基因序列；引导载体重组于毕赤酵母基因组或酿酒酵母基因组的同源序列；大肠杆菌复制起点。

4.通过电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母，将以上构建的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母。分别筛选高表达木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶的重组子作为工程菌。

5.分别发酵以上构建的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶。

本发明构建含木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶木霉的基因表达框架的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶的优点体现于：

(1)用工程菌取代天然菌株生产木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶木霉，通过增加基因拷贝数而提高酶的产量。

(2)用含木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架的工程菌取代含单一酶基因的工程菌生产酶，用一个发酵工序同时生产木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶木霉取代了用三个工序分别生产重组木质素过氧化物酶或猛过氧化物酶或漆酶。节省了原材料、能耗和人力资源。

(3)酿酒酵母和毕赤酵母在生产重组蛋白方面各具特征，本发明分别构建含木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌和毕赤酵母工程菌，为其重组酶生产提供两种菌株选择。

具体实施方式

下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。

实施例一

1.1构建克隆载体

由专业的DNA序列合成公式合成大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为PM。

1.2获取目标基因和构建表达载体相关元件的DNA序列