[发明专利]一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法。

背景技术

近年来，骨髓间充质干细胞，作为移植治疗中枢神经系统疾病的种子细胞之一，在基础实验与临床试验均得到了广泛的研究和关注。就当前的研究而言，骨髓间充质干细胞参与修复中枢神经系统疾病的机制主要包括：细胞替代，因子分泌，促血管生成等。为了进一步探索骨髓间充质干细胞与中枢神经系统中神经元之间的相互作用，并达到最简化的模型来对骨髓间充质干细胞修复中枢神经系统疾病机制的精确探索，那么将体内移植的实验转移到体外并模拟构建体外移植模型：即将皮层神经元与骨髓间充质干细胞行共培养，以观察两种细胞间的相互作用为基础，为后续众多研究提供研究方法，实验工具和深入研究的基础。

目前，还未有单位或者个人进行这个方面的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法，该方法通过将皮层神经元与骨髓间充质干细胞行共培养，观察两种细胞间的相互作用，建立一种模拟骨髓间充质干细胞移植的体外模型，并能观察到细胞间突触样结构的形成。

本发明的上述技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法，含以下步骤：

(1)选取离体乳鼠皮层神经元，经培养鉴定后待用；

(2)选取离体大鼠骨髓间充质干细胞，经培养鉴定后待用；

(3)将大鼠骨髓间充质干细胞经预处理后，接种于步骤(1)的乳鼠皮层神经元中进行共培养，接种密度为1.0-5.0×10⁴个/cm²，共培养时间为4~6天；

(4)将共培养后的大鼠骨髓间充质干细胞和乳鼠皮层神经元经光镜、荧光显微镜、原子力显微镜及扫描电镜检测，确立模拟骨髓间充质干细胞移植的体外模型建立，并在超微结构上鉴定确定皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间突触样结构的形成。

本发明步骤(1)中离体乳鼠皮层神经元优选通过免疫荧光法来鉴定乳鼠皮层神经元。

本发明步骤(2)中大鼠骨髓间充质干细胞优选采用流式法进行鉴定。

本发明步骤(3)中大鼠骨髓间充质干细胞预处理时优选为：取步骤(2)中的大鼠骨髓间充质干细胞，经胰酶消化，离心后，再经DMEM/F12培养基、2%B-27和2%胎牛血清重悬处理大鼠骨髓间充质干细胞即可。

本发明具有如下优点：

(1)本发明为间充质干细胞移植提供了一个简化的体外模型，在此模型的基础上，可以继续深入的进行大量的基础研究，比如进行基因敲除来鉴定某些基因、小RNA及药物在移植过程中发挥的作用，为进一步研究间充质干细胞移植修复损伤的机制提供了很简化且很好的平台；

(2)本发明模拟的体外模型中所形成的突触样结构为间充质干细胞损伤机制提供了结构整合机制的体外证据；

(3)本发明模拟的体外模型，比起体内试验，能够更精确的反应修复过程中其决定性作用的因素，避免了体内微环境中复杂成分的干扰。

附图说明

图1是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天，低倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图2是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天，高倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图3是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天抗MAP2蛋白阳性，荧光显微镜bar=100μm；

图4是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天抗β-tubulin蛋白阳性，荧光显微镜bar=100μm；

图5是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天，低倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图6是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天，高倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图7是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天FITC同型对照阴性，流式细胞仪；

图8是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天CD34表达阴性，流式细胞仪；

图9是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天CD29表达阳性，流式细胞仪；

图10是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天CD90表达阳性，流式细胞仪；