[发明专利]油菜BnRabGDI3启动子的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种分离的启动子PBnRabGDI3，其序列为SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种分离的启动子，其特征在于：所述的启动子含有重组载体pBI- PBnRabGDI3。

3.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜启动子PBnRabGDI3的制备方法，其步骤是： 

（1）油菜启动子PBnRabGDI3的引物序列：

根据油菜全基因组测序获得的Bn RabGDI3基因上游2kb序列设计一对引物进行PCR扩增，扩增获得油菜BnRabGDI3的5’上游启动子序列，所用引物为PBnRabGDI3S：5 ′CAGaagcttGAGTAAATACAGAACAGTGTTAC-3 ′和PBnRabGDI3A：5′-  GACAtctagaTGTTGCAACCAATCTCTATTATC-3 ′;

（2）油菜启动子PBnRabGDI3的制备:

根据油菜全基因组测序获得的BnRabGDI3的5’上游2kb序列设计所用的引物：PBnRabGDI3S和PBnRabGDI3A，利用SDS裂解法提取油菜叶片基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，步骤是：提取油菜基因组DNA 25μl，以此为模板进行扩增，反应体系为50 μl，分别添加10×Ex Taq buffer 5 μl，dNTP 4 μl，5’引物 1 μl，3’引物 1 μl，ExTaq  0.5 μl，DNA模版1 μl50ng，ddH2O 37.5μl， 扩增产物大小为2064 bp，PCR反应程序为94℃ 5 分钟，94℃1 分钟，60℃ 1分钟，72℃ 2分钟，33个循环，72℃ 10分钟，16℃ 3小时，PCR产物经1.0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒纯化回收后，连接到pMD18-T载体，热激法转化gold菌株的感受态细胞，挑取阳性克隆，PCR检测阳性和酶切验证后测序，得到目的基因上游2kb侧翼序列，经过生物信息学分析此序列为BnRabGDI3的启动子全长序列，命名为PBnRabGDI3。

4.权利要求1中所述的一种分离的启动子PBnRabGDI3在拟南芥花药中的应用。

5.权利要求1中所述的一种分离的启动子PBnRabGDI3在拟南芥花粉粒中的应用。