[发明专利]重组人尿胰蛋白酶抑制剂的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组人尿胰蛋白酶抑制剂的生产方法。

背景技术

早在1985年，日本就将从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂(h-UTI)用于临床实践，而国内1994年广州天普(Techpool)生化医药股份有限公司也将提取的h-UTI用于临床。h-UTI的主要适应症为急性胰腺炎，慢性胰腺炎的急性发作，急性循环衰竭，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺铂化疗时对肾功能的损伤，AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。该提取成分临床疗效明确、副反应小、生产成本低，但是作为从人尿中提取的一类药物，由于其含量低、收集人尿困难、分离纯化成本高；再加上不可避免各种病毒污染的可能性，限制了该产品的广泛应用。

能采用基因重组的手段获得重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant Human Urinarytrypsin irmibitor，rh-UTI)是一项能将基础和应用研究有机结合的工作，但是，早年有报道称h-UTI糖蛋白分子中的硫酸软骨素分子是h-UTI发挥胰蛋白酶抑制剂作用的必要部分(Selloum，L.，etal.，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，368：47～55，1987)，因此，在非哺乳动物细胞表达系统(如，E.coli，酵母)中产生的rh-UTI能不能形成正确的糖基化修饰是非常关键的。但是，德国的Bayer Aktiengesellschaft公司1995年申请的美国专利(US5407915，Human bikunin variants as proteinase inhibitors，and medicaments containingthese)就很好地证明了糖基化并非是其活性所必须的，该专利中还描述了啤酒酵母表达的rh-UTI分子的N-端有严重的不均一性问题：60％rh-UTI具有天然的N-端，而40％的N-端少一个丙氨酸(Ala)。之后，有许多研究都表明，E.coli重组表达的rb-UTI同样具对胰蛋白酶等酶抑制作用(Brithma：nn，T.，etal J Biol Chem.，272(17)：11171～11175，1997)，很明显，糖基化修饰在h-UTI分子中的作用需要重新审视。不过用现有的酵母或大肠杆菌生产rh-UTI的产量太低，加之蛋白的均一性不能保证，虽有一些研究报道，但是一直没有规模化生产和动物模型试验方面的研究报道，因此，有关rh-UTI的临床价值仍然十分难以确定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的缺陷，提供一种产量高，质量有保证的生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法。

本发明是这样实现的：

一种生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂(th-UTI)的方法，包括：

将人的h-UTI基因与人血白蛋白的第一个结构域基因序列(SEQ ID NO：1)融合后，插入到专门的表达载体PlCZa中表达，构造的工程菌种按照Invitrogen的发酵操作手册中的程序，在30L发酵罐中进行发酵，其中发酵过程的关键性参数是pH6.0、30℃、溶氧在20％-30％之间，诱导时间为50小时；诱导结束后离心收集发酵上清液，添加NaCl，用NaOH调节发酵上清液的pH至7.4，添加磷酸盐至终浓度为50mM，膜过滤即得可用于Ni2+-螯合层析上样的发酵液；50mM咪唑洗脱下DoI-UTI融合蛋白，脱盐并将DoI-UTI转换到肠激酶的酶切缓冲溶液中，酶切完成后再过螯合层析介质和离子交换介质就可以得到th-UTI。

更进一步的方案是：所述的专门的表达载体PlCZa是指线性化的PICZa-Do1-UTI表达载体。

更进一步的方案是：所述的表达菌株是GS115.UTI1，GS115.UTI2和GS115.UTI8菌株中的任意一种。