[发明专利]一种产牛磺酸菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产牛磺酸

说明书

技术领域

一种产牛磺酸的枯草芽孢杆菌的筛选方法及应用该菌株生产牛磺酸，属于生物工程领域，特别是一株产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。

背景技术

牛磺酸(Taurine)是动物体内的一种含硫氨基酸，又称牛胆碱、牛胆素，其化学结构式为H₂N-CH₂-CH₂-SO₃H，化学名称为2-氨基乙磺酸。它广泛分布于生物体内各组织、器官，主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中，因最先从牛胆汁中分离出来而得名。1954年Stern和Moore首次在脑和脊髓中发现了牛磺酸。但长期以来一直被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物^[1]。1976年Hayes等首次报道用以酪蛋白为主要蛋白来源但缺乏牛磺酸的饲料喂猫，可引起猫的视网膜变性，若长时间缺乏，可使猫失明，从而引起了人们对牛磺酸营养作用的极大关注。研究发现，牛磺酸是调节机体正常生理活动的活性物质，具有维持正常视觉功能、维持机体渗透压平衡，调节细胞钙平衡，与细胞膜的流动性有关，降血糖、调节神经传导、参与内分泌活动、调节脂类消化与吸收、增加心脏收缩能力、提高机体免疫能力、增强细胞膜抗氧化能力、保护心肌细胞等广泛生物学作用。

牛磺酸在临床上已被广泛应用于心血管疾病、高胆固醇血症、眼部疾病、糖尿病、早老性痴呆和肝病等一系列疾病的治疗。在食品领域，牛磺酸的已经成为多种食品营养强化剂和添加剂的主要活性成分，作为食品添加剂，其可被添加到乳制品、饮料、豆制品等食品中。目前，世界上牛磺酸的年消耗量已超过1.5万吨/年，其中80％以上用作食品营养添加剂。我国生产的牛磺酸主要用于出口、医药以及食品，其中出口量约占90％，作为食品添加剂仅占6％，而美国仅在饮料食品中作营养强化剂一项消费就近每年1万吨。随着国内人民生活水平和健康意识的提高，牛磺酸作为营养保健品和强化食品添加剂将越来越受到人们的重视，市场需求趋旺，具有巨大的发展潜力和空间。

由于牛磺酸在天然生物中较分散、量少，从天然生物品中提取的量也很有限。所以目前牛磺酸的获取主要还是靠化工合成。如利用2-溴乙胺氢溴酸盐与Na₂SO₃，反应制备牛磺酸，虽然产率较高，但成本很高，难以实现工业化，而使用低成本的合成方法如2-氯乙胺盐酸盐与Na₂SO₃反应，则收率较低。目前，牛磺酸的生产厂家主要集中在日本、美国、欧洲等发达国家和地区，我国牛磺酸生产工艺陈旧、成本高、产量低，与欧美等发达国家还有很大差距。

早在1988年日本就有专利报道，可用发酵法制取牛磺酸，并同时报道了许多种类的微生物都能生产牛磺酸或其类似物。然而近几十年来，鲜有关于采用微生物发酵法生产牛磺酸的研究报道，仅在2009年Choi Y.J.等报道了采用代谢工程的方法在大肠杆菌中生产牛磺酸。

对采用微生物发酵法生产牛磺酸的研究尚处于初步阶段，仍没用一种可以利用微生物发酵直接生产牛磺酸的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛磺酸生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产牛磺酸。

本发明的技术方案：

1、一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法：

1)枯草芽孢杆菌的初步分离纯化

称取约0.2g土壤于20ml 0.85％无菌生理盐水中，将菌悬液在沸水中振荡加热10min后，迅速冷却至室温。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-8，取10^-6-10^-8稀释菌液涂布于营养肉汤平板上，30℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色，显微镜下观察芽孢，将有芽孢菌株作为进一步筛选的枯草芽孢杆菌疑似菌株，编号保存；

2)产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选

将上述分离纯化得到的菌种接种于种子培养基中，然后转接到发酵培养基中，培养24h后离心收集发酵液，发酵液经高效液相方法中的内标法进行分析，使得牛磺酸标准品峰高增高的菌株即为产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。

2、根据权利要求1所述一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法，其筛选得到产牛磺酸的枯草芽孢杆菌的鉴定方法如下：

1)形态学鉴定

菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色；

2)生理生化鉴定

接触酶试验，V.P.及M.R.试验，明胶液化及淀粉水解，耐盐耐酸试验，硝酸盐还原试验；

3)16sRNA分子生物学鉴定