[发明专利]一种凝血八因子及其变异体纯化方法

说明书

技术领域

本发明公布一种用抗体片段纯化凝血八因子的方法。

背景技术

凝血八因子(coagulation factor 8，FVIII)是一种在血液凝固中起重要作用的蛋白质。凝血八因子缺陷会导致A型血友病(Nature 312：342-347，1984；，Nature 312：337-342，1984)。血友病是一种严重的遗传病。患者从出生开始，就会反复发生出血。这种出血，不仅仅是在发生外伤或手术时，还会自发地出现在关节、肌肉等部分，久而久之，会使患者出现慢性关节炎并最终导致残疾。如果一旦出现颅内出血、喉部出血，将会直接危及生命。

A型血友病唯一的治疗方法是静脉注射凝血八因子。凝血八因子可以从血浆中纯化提取，也可以用基因工程重组的方法用哺乳动物细胞培养进行生产。由于血浆原料具有潜在疾病传染性，重组凝血八因子更好。但是，由于凝血八因子分子巨大，难以表达，细胞合成的凝血八因子难以分泌到细胞外，而且分泌到细胞外培养液中的凝血八因子易于降解，基因工程重组凝血八因子的产率，比其他分子的产率要低几百倍到几千倍(Human Gene Therapy 4：259-272，1993；Blood Cells，Molecules，and Diseases.28：234-248，2002；Blood.103：3412-3419，2004)。因此，基因工程重组凝血八因子生产成本高，价格昂贵。

在过去的时间里，有许多方法试图增加凝血八因子产率。增加凝血八因子产量的方法主要有两种策略。第一是上游增加哺乳动物生产凝血八因子的产率，第二是下游增加纯化效率。

增加凝血八因子产率的一个主要策略是将凝血八因子与vWF(von Willebrand factor)联合共同表达(J.Biol.Chem.263，6352-6362，1988；Mol.Cell.Biol.9，1233-1242，1989；J.Biol.Chem.266，21948-21955，1991)。凝血八因子还可以与其他分子联合表达，以增加表达量。例如Fontes等将凝血八因子与P140K基因联合表达，增加凝血八因子在293T细胞中的表达(Genet Mol Res.11(1)：775-89，2012)。

凝血八因子的B结构域在凝血活性中不起作用，去除B结构域的凝血八因子变异体，分子要比全长分子小，表达率要高(美国专利号码5,661,008，WO-A-91/09122，美国专利号码5,112,950，美国专利号码7,041,635)。

在培养基中添加某些成分，增加凝血八因子表达或者降低凝血八因子的降解，是提高凝血八因子产率的另外一种主要策略。在培养基中添加外源vWF因子可以与凝血八因子结合降低凝血八因子降解(J.Biol.Chem.263：6352-6362，1988)。在培养基中，加入ortho-phospho-L-serine(OPLS)，降低凝血八因子与细胞膜的结合以增加表达(J.Biotechnol.151：357-62，2011)。在培养基中加入高分子量的dextran sulfate，也可以降低分泌的凝血八因子降解(美国专利申请US20100112641)。

在提高纯化产率方面，应用固定化抗体纯化抗原凝血八因子，以提高纯化回收率，是一项广泛应用的策略(美国专利号码5,470,954，美国专利号码RE32011)，与离子交换层析纯化方法相比较，亲和层析的回收率较高，得到的蛋白质纯度较高。所有这些抗体亲和层析方法都是应用全长抗体分子。全长抗体分子需要用杂交瘤细胞培养或者其他哺乳动物细胞培养获得。用哺乳动物细胞培养方法制备全长抗体分子的成本比较高，这在凝血八因子制造总成本中占相当大的比例。

本项发明是用凝血八因子或者vWF因子抗体片段分子，常用单链可变区((single chainantibody fragment，scFv)分子，进行固定化，用于分离纯化凝血八因子。

发明内容

本项发明，是应用抗体片段而不是完整抗体分子进行“凝血八因子”的免疫亲和纯化。

抗体片段scFv通常用细菌进行表达生产制备。而抗体全长分子通常要用哺乳动物细胞培养进行表达生产制备。与哺乳动物细胞培养相比较，用细菌进行生产，可以极大幅度地降低生产成本。