[发明专利]一种在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置及方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种快速在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置及方法，该装置及方法适用于在线快速测定尿液或血浆样品中巯基氨基酸及氨基酸二硫化物的含量。

背景技术

生物流体中巯基氨基酸和氨基酸二硫化物的含量与人体的健康息息相关。通过对巯基氨基酸和氨基酸二硫化物含量的测定，可以实时监控人体的健康。目前所用的方法是通过离线将其中的氨基酸二硫化物还原成相应的巯基氨基酸，然后再测定各种巯基氨基酸的含量，从而确定样品中各种氨基酸的含量。文献Muhammad I.K.,Zafar I.Simultaneous determination ofascorbic acid,aminothiols,and methionine in biological matrices using ion-pairing RP-HPLCcoupled with electrochemical detector.J.Chromatogr.,B,2009,877:2567–2575.介绍了该方法。这种离线操作不仅浪费时间，而且巯基氨基酸在样品处理和接下来的分析过程中容易被自动氧化成氨基酸二硫化物。文献James L.,James D.The determination of disulphide species withinphysiological fluids.Trends Anal.Chem.,2012,21:807-815.报道了采用电化学或者质谱方法直接同时在线测定巯基氨基酸和氨基酸二硫化物，该测定方法程序上比较简单，但是电化学方法电极稳定性差，容易受干扰物质影响，导致灵敏度降低；质谱方法设备复杂，而且昂贵。目前多数测定巯基氨基酸和氨基酸二硫化物还是采用间接方法，这些方法操作步骤多，比较浪费时间。因此，需要设计一种能够快速简单在线还原并同时测定氨基酸二硫化物及巯基氨基酸的方法，通过将分离系统、在线还原系统和测定系统连接起来，达到同时测定巯基氨基酸和氨基酸二硫化物的目的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种快速的在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置及方法，

本发明所提供的在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置如图1所示，其中主要由高压泵、高效液相色谱分离柱、在线还原柱、化学发光检测器组成；其中高压泵(1a)经过六通进样阀（2）依次与高效液相色谱分离柱（3）和在线还原柱（4）连接，再与化学发光检测器连接（5）。在线还原柱（4）与化学发光检测器（5）之间依次有泵(1b)、泵(1c)、泵(1d)通过T型连接管接入。

所述的在线还原柱（4）的结构如图2，是由树脂管（1）、玻璃纤维（2）、TCEP络合物晶体（3）和石英管（4）构成的，其中TCEP络合物晶体（3）填充在石英管（4）中，两端都填有玻璃纤维（2），石英管（4）的两端分别用树脂管（1）与其他仪器连接。

所述的石英管长度为4-12cm，内径为1-3mm；石英管在使用前要用纯水冲洗干净，于100℃烘箱中干燥2-3小时；还原柱在使用前要用纯水冲洗3个小时。

所述的TCEP络合物晶体是锌(II)的三(2-羧乙基)膦络合物晶体。

利用该装置进行在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的测定方法是：同时启动4个高压泵（1a）、（1b）、（1c）、（1d）分别将三氟乙酸溶液、三角形金纳米溶液、鲁米诺溶液、过氧化氢溶液同时注入系统；其中三氟乙酸溶液流过六通进样阀（2）时，将通过注射器（6）注入到六通进样阀（2）中的待测样品载入高效液相色谱分离柱（3），样品中的各种氨基酸被分离后进入在线还原柱（4），溶液中的氨基酸二硫化物被TCEP络合物还原成相应的巯基氨基酸，再依次与三角形金纳米溶液、鲁米诺溶液、过氧化氢溶液在线混合，最后进入化学发光检测器（5）进行在线测定。

所述的待测样品是人体血浆或尿液，其中所含的氨基酸是巯基氨基酸和氨基酸二硫化物的混合物，其中巯基氨基酸是半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽和谷氨酰半胱氨酸的混合物；氨基酸二硫化物是胱氨酸和高胱氨酸的混合物。