[发明专利]一种细胞共养的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞共养的方法，有助于医学和生物学方面今后对细胞间相互关系的研究。

背景技术

细胞是组成有机体的形态和功能的基本单位，自身又是由许多部分构成的。关于结构的研究不仅要知道它是由哪些部分构成的，而且要进一步搞清每个部分的组成。相应地，关于功能不仅要知道细胞作为一个整体的功能，而且要了解各个部分在功能上的相互关系。有机体的生理功能和一切生命现象都是以细胞为基础表达的。因此，不论对有机体的遗传、发育以及生理机能的了解，还是对于作为医疗基础的病理学、药理学等以及农业的育种等，细胞学都至关重要。

对于研究细胞起了巨大推动作用的是M.J.施莱登和T.A.H.施万。前者在1838年描述了细胞是在一种粘液状的母质中经过一种像是结晶样的过程产生的，而且首先产生出核（还发现核仁）。他并且把植物看作细胞的共同体，就好像水螅虫的群体一样。在他的启发下施万坚信动、植物都是由细胞构成的。他积累了大量事实，指出二者在结构和生长中的一致性，于1839年提出了细胞学说。与此同时，捷克动物生理学家J.E.浦肯野提出原生质的概念;德国动物学家C.T.E.von西博尔德（1845）断定原生动物都是单细胞的。德国病理学家R.C.菲尔肖(1855)在研究结缔组织的基础上提出“一切细胞来自细胞”的名言，并且创立了细胞病理学。德国动物学家M.舒尔策在1861年对细胞下了定义：“细胞是一团具有一切生命特征的原生质，细胞核处于其中。”

细胞间相互关系是当今医学和生物学研究的一个重要方向。要进行这方面的研究往往离不开细胞培养，特别是细胞共培养(coculture) 。我们介绍一种简单易行的细胞共培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞共养的方法，通过细胞共培养的手段观察两种不同类型细胞之间的相互作用，有效提高药物的生物利用度，延缓药物的释放，增强药效，降低毒副作用，达到缓释、长效、靶向的目的。所介绍的细胞共培养方法，其特点为：（1）简单易行，在一般实验室即可进行；（2）在共培养过程中可以清楚地观察到2种细胞的生长情况，便于拍照等观察，不象微孔底膜套皿不易观察细胞生长情况；（3）在细胞接种时，玻片大小一样，玻片上的细胞数可由每孔总的细胞数减去每孔剩余的细胞数而得，只要在实验前试验几次即可得到；（4）共培养的是贴壁细胞，细胞不易交叉污染；（5）通过在筛网上再固定盖玻片的方法还可观察3种贴壁细胞的共培养情况；（6）实验结束后可在玻片上进行扫描电镜、免疫组化等研究。

具体实施方式

（1）共培养的准备，盖玻片、24孔板、不锈钢筛网；

（2）细胞单独培养，从组织中取细胞样品分离鉴定培养；

（3）细胞共同培养实验，取单独培养好的细胞计数后接种于24孔板中，加入血清培养液，培养24小时，细胞快呈融合生长状态时，更换小牛血清的DMEM，每孔加入庆大霉素24小时后进行共培养。

实施例1

（1）共培养的准备：:盖玻片用玻璃刀裁成刚好能放入24孔板的正方形，按细胞培养用品要求清洗后消毒备用，不锈钢筛网用剪刀剪成正方形，再把筛网的钢丝弯成垂直于网面的支脚，大小以能放入24孔板孔为宜，使上下二层细胞相差1mm，清洗后消毒备用。

（2）细胞单独培养:大鼠肾间质成纤维细胞和大鼠肾小管上皮细胞的培养与鉴定按文献报道进行，培养成功后进行下列实验，以观察上述装置培养细胞的可行性，实验前大鼠肾小管上皮细胞和大鼠肾间质成纤维细胞均作锥虫蓝(0.4 %) 染色，检测细胞的活性状态。

（3） 细胞共同培养实验:将原代培养的大鼠肾小管上皮细胞消化后计数，按每孔1×10⁵个细胞接种于预先放有备用盖玻片的24孔板中，以含10%小牛血清的DMEM培养液培养24小时，细胞快呈融合生长状态时，更换培养液为含1%小牛血清的DMEM，每孔加入200μg/ml庆大霉素24小时后进行共培养。取第3代的大鼠肾间质成纤维细胞，按每孔1×10⁵细胞数植入24孔板内以含10%小牛血清的DMEM培养液培养12小时，细胞贴壁生长后，将培养液更换为含1%小牛血清的DMEM继续培养24小时，放入备用不锈钢筛网，再放入上述长有大鼠肾小管上皮细胞的盖玻片，共培养48小时后，去盖玻片及不锈钢筛网，用四甲基偶氮多胍(MTT) 掺入法测定大鼠肾间质成纤维细胞的增殖情况。