[发明专利]一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因、蛋白及其抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL）基因、蛋白及其抗体的制备，属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL），又称为凋亡素2配体（APO2 ligand,APO-2L）(Wiley et al.,1995；Pitti et al.,1996)，其胞外结构域在金属蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的细胞因子sTRAIL（Soluble TRAIL ），TRAIL具有TRAIL的生物学功能（Bodmer et al.,2000）。TRAIL是TNF超家族中一类重要的跨膜细胞因子(Wiley et al.,1995；Pitti et al.,1996)，可选择性地引起人类大多数肿瘤细胞发生细胞凋亡：包括脑、肾、肝、肺、胃、结肠、乳腺、前列腺、胰腺、胆管、宫颈、皮肤和造血系统来源的肿瘤细胞，而对正常细胞无或仅具有极低的毒性（Dphil，2007;马远方,2007），以TRAIL为靶点的分子治疗已成为肺癌等癌症治疗的新热点。

我国是水产大国，三角帆蚌等贝类养殖是我国水产养殖的支柱产业之一。三角帆蚌不仅肉质细嫩、营养价值高，还具有抗癌降血脂等功效。目前国内外通过提取三角帆蚌等贝类体内的多糖等生物活性物质，并开发出了保健食品。但以上多为多糖等物质的混合物，是免疫调节产品，并且基础研究资料少，对肿瘤细胞的毒性作用较低，对其功效及副作用等所知不多。因此利用基因工程技术开发三角帆蚌中sTRAIL蛋白抗体产品，有助于新型抗肿瘤药物的研制与开发。

 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL）基因、蛋白及其抗体的制备，设计了扩增三角帆蚌中sTRAIL编码序列的寡聚核苷酸引物，获得了三角帆蚌sTRAIL基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体，表达并纯化了可溶性的sTRAIL蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白质，具有SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。

一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的抗体的制备方法，包括如下步骤：

1）以三角帆蚌血淋巴细胞的总RNA为模板，反转录成cDNA，扩增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物,所述的引物具有SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列的，利用PCR技术获得具有SEQ ID NO.1所示的sTRAIL的基因编码框核苷酸序列；

2）利用DNA重组技术将sTRAIL基因编码框的序列片段克隆到合适的pMD19-T载体（Takara公司，日本）中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-28(a) 原核表达载体（Novagen公司，美国）连接，利用PCR法筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体pET-28a(+)-sTRAIL；

3）将阳性重组质粒pET-28(a)- sTRAIL转化到表达宿主菌E. coli Rossetta（DE3 ）( 天根公司，中国），用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）(Sigma公司,美国)诱导表达，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测；

4）将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒（Merck公司，德国）分离纯化重组蛋白质，制得的重组蛋白质具有SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列；

5)用纯化得到sTRAIL重组蛋白免疫新西兰大白兔，经过一次初始免疫和三次加强免疫后，颈动脉取血，分离血清，获得sTRAIL多克隆兔抗血清。

本发明的有益效果为：本发明设计了扩增三角帆蚌中sTRAIL编码序列的寡聚核苷酸引物，获得了三角帆蚌sTRAIL基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体，表达并纯化了可溶性的sTRAIL蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清，有助于新型抗肿瘤药物的研制与开发。

 

具体实施方式

实施例1