[发明专利]Amycolatopsis sp.CGMCC1149新型羟基化酶(细胞色素P450)基因克隆及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种Amycolatopsis sp.合成无锡他汀过程中羟基化酶细胞色素P450基因的克隆及利用该酶进行生物转化合成无锡他汀新方法。 

背景技术

胆固醇含量升高是引起高血脂的主要原因，在胆固醇合成过程中，羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶是关键限速酶。HMG-COA还原酶抑制剂能抑制其酶活，使其无法发挥正常作用，减少胆固醇的生成，达到降低血脂的目的。 

他汀类药物属于HMG-COA还原酶竞争性抑制剂，为降脂药物中的首选药物。本实验在专利号为：200410044893.6，专利名称为：一种拟无枝酸菌及其生物转化洛伐他汀为无锡他汀的技术中公开了一种生产无锡他汀的方法。无锡他汀对HMG-COA还原酶的抑制作用是洛伐他汀的4倍，半致死量(LD50)为洛伐他汀的1.5倍，是一种新型的、潜在的、高效的HMG-COA还原酶抑制剂。 

Amycolatopsis sp.合成无锡他汀分两步进行：首先，洛伐他汀羟基化为产物I，由羟基化酶催化完成；产物I经异构化为无锡他汀，由异构酶催化完成，其中羟基化酶(细胞色素P450)是关键酶。由于细胞色素P450在Amycolatopsis sp.中的表达水平比较低，并且洛伐他汀对菌体具有一定的毒害作用，这些都限制了无锡他汀产量的提高。为了克服上述不利因素，本发明克隆细胞色素P450基因全序列，进行高效表达，并建立洛伐他汀体外羟基化体系及一种生物转化合成无锡他汀新方法。 

发明内容

细胞色素P450是Amycolatopsis sp.合成无锡他汀的关键酶，本发明的目的提供一种新的Amycolatopsis sp.细胞色素P450基因序列及利用该酶进行生物转化合成无锡他汀新方法。 

本发明中，术语“细胞色素P450”、“CYP”、“羟基化酶”可以互换使用，都指具有相应基因编码的氨基酸序列的蛋白；“Amycolatopsis sp.CGMCC1149”、“Amycolatopsis sp.”可以互换使用，为同一株菌。 

本发明的技术方案： 

(1)利用引物P-F：5′-GACGAATTCATGACCCAGACGGTTCC-3′和P-R：5′-TAGAAGCTTTTACCAGGTGACCGGCAG-3′，克隆Amycolatopsis sp.细胞色素P45 0基因SEQ ID NO.1； 

(2)构建包含SEQ ID NO.1的表达载体，在原核宿主中高效表达，表达的蛋基酸序列为SEQ ID NO.2，该蛋白具有将洛伐他汀羟基化的功能； 

(3)利用该表达蛋白，建立洛伐他汀体外羟基化体系，用于洛伐他汀羟基化产物I的体外合成。反应体系为：总体积200μL，纯CYP，0.26mM NADH，铁氧还蛋白还原酶(0.04U)，320μg铁氧还蛋白，0.23mM洛伐他汀，100mM PBS缓冲液(pH7.4)补足200μL。于30℃、150r/min水浴反应6h，105℃、5min终止反应。 

(4)建立一种利用该酶进行生物转化合成无锡他汀新方法，即两步法：首先，应用上述建立的洛伐他汀体外羟基化体系进行体外合成产物I，收集并提纯产物I；其次，将产物I作为底物进Amycolatopsis sp.发酵培养合成无锡他汀。 

本发明的有益效果：从Amycolatopsis sp.基因组克隆无锡他汀合成关键酶细胞色素P450基因SEQ ID NO.1，并实现其在原核宿主中高效表达，建立洛伐他汀体外羟基化体系及一种利用该酶进行生物转化合成无锡他汀新方法，克服洛伐他汀对菌体的毒害作用等不利因素对无锡他汀产量提高的限制，为实现无锡他汀的生产应用提供一种新方法。 

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。 

实施例1：表达质粒的构建 

根据SEQ ID NO.1核苷酸序列设计一对引物 

P-F：5′-GACGAATTCATGACCCAGACGGTTCC-3′； 

P-R：5′-TAGAAGCTTTTACCAGGTGACCGGCAG-3′； 

为方便将PCR片段连接到质粒pEtac上，在两引物的5′端分别引入EcoR I和HindIII酶切位点，下划线“_”表示引入的酶切位点。