[发明专利]双表达的AAV重组病毒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种双表达猪繁殖与呼吸综合征病毒shRNA及ORF5-6免疫组合基因的AAV(Adeno-associated Virus)重组病毒的制备方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种使特定基因沉默、使其功能丧失或降低，具有高度序列专一性的RNA诱导的转录后调控方式，是研究基因功能、肿瘤基因治疗、抵御病毒侵袭的一种有效的手段。目前进行RNAi的策略主要有人工合成双链RNA、PCR产物直接导入、载体介导和病毒介导。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体由于具有安全性好、免疫原性低、可转导分裂细胞和非分裂细胞及介导外源基因的长期表达等特点，在基因治疗研究中受到了广泛关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种双表达的AAV重组病毒的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种双表达的AAV重组病毒的制备方法，采用基因克隆技术将合成的特异性PRRSVRNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper Free System中的表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP的U6启动子下游，将PRRSV的ORF5-6结构蛋白基因克隆至pAAV-U6-IRES-hrGFP的CMV启动子的下游，构建成双效腺相关病毒载体pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-ORF5-6，通过酶切及PCR鉴定后进行DNA测序以鉴定重组质粒。

优选的，所述的制备方法，具体方法包括以下步骤：

1)pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA质粒表达载体的制备：

PRRSV-shRNA引物序列的设计及合成：针对PRRSV JXA1毒株的基因组序列，设计筛选并合成DNA模板引物：

SH-A：5’-GATGACGTCAGGCATCACTTTCAAGACGAGTGATGCCTGACGTCATCTTTTTTT-3’

SH-B：：5’-AAAAAAGATGACGTCAGGCATCACT CGTCTTGAA AGTGATGCCTGACGTCATC A-3’；

设立阴性对照，目的序列为已知序列碱基序列打乱后重排所得，酶切位点和发卡环结构相同；合成的单链目的基因片段的退火连接后形成双链DNA，与经Xba I和Age I双酶切的载体pAAV-U6-IRES-hrGFP连接后转化，提取质粒进行PCR鉴定，并经DNA测序法鉴定，得到干扰性质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA；

2)双表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-6的构建：

PRRSV免疫蛋白组合基因ORF5-6的获得：

针对PRRSV设计ORF5及ORF6全基因设计其引物，引物序列分别为：

F51：5’-ataGGATCCACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3’(BamH I)

F52：5’-GCGAATTC AAGAAGGTCAAAATTCAACAG ctagagacgaccccatag-3’(EcoR I)

F61：5’-ATAGAATTC atggggtcgtctctagacga-3’(EcoR I)

F62：5’-AGC ctcgag ttatttggcatatttaacaagg-3’(Xho I)

利用Qigen RNA提取试剂盒提取PRRSV JXA1毒株RNA，利用RT-PCR法获取ORF5及ORF6基因后连接到pMD18-T载体上进行进行DNA测序分析；