[发明专利]一种有效提高苦荞麦总黄酮含量的组培方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荞麦的组织培养方法，特别是涉及一种可有效提高荞麦总黄酮含量的组培方法。 

背景技术

荞麦是一种药食同源的植物，有苦荞和甜荞两种。由于苦荞麦其籽粒、根、茎、叶及花等多种器官中都含有大量黄酮类物质，因而被誉为“降血糖、降血压、降血脂”的三降食品。随着其营养价值和药用价值的不断发现，苦荞麦植物资源越来越受到人们的青睐。但由于苦荞麦植物具有自花授粉的特点，因而导致其在农业生产育种上存在人工杂交难以成功，这也是当前苦荞麦在育种方面难以获得高产优良品种的重要原因。组织培养可在一定程度上解决苦养麦在育种上所遇到的问题。目前已有以苦荞麦茎段、叶片、叶柄为外植体培养其愈伤组织的报道。 

大量研究表明，在植物细胞的悬浮培养过程中，通过加入最终目的化合物的前体物，可以大大提高悬浮培养细胞的次生代谢物含量。目前还未见采用前体饲喂技术来显著提高苦荞麦组培物中总黄酮含量的报道。 

发明内容

本发明的目的在于一种有效提高苦荞麦总黄酮含量的组培方法，该方法通过在荞麦细胞的液体培养中添加特定的前体物来有效提高荞麦培养物中的总黄酮含量。 

为达到上述目的，本发明采用的解决方案包括如下步骤： 

(1) 外植体的处理：选取生长健康和无病虫害的苦荞茎段作为外植体， 并进行消毒处理； 

 (2) 愈伤组织的诱导培养：取消毒后的外植体，吸干表面的水分后切成0.5cm～1.5cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 0.1～2.0mgL+2，4-D 1～6mgL+IAA 0～1mgL+蔗糖20～60 gL^-1+琼脂5.0～7.0 g·L^-1中进行培养，培养条件为pH值5.5～6.8、每天光照8～16小时、光照强度1000～2000 lx、培养温度18～28℃； 

 (3) 愈伤组织的悬浮培养：切取生长15～25天的愈伤组织，以10～50 g·L^-1的接种量接入到添加有前体饲喂物的液体培养基MS+6-BA1.0～2.0mgL^-1+NAA0.1～0.5 mgL^-1+蔗糖20～60 gL^-1+Vc 100～300 mg L^-1中进行悬浮培养，培养条件为pH值5.5～6.5，培养温度18～24°C、每天光照8～12小时、光照强度600～1000 lx，摇床转速为120～140r/min，所述前体饲喂物为乙酸钠或酵母提取物，乙酸钠的加入量为1～10 mgL，酵母提取物的加入量为0.5～5gL。 

将上述悬浮培养25天后的愈伤组织细胞从培养液中滤出，用干燥滤纸拭干材料表面水分后，称取重量，即为鲜重；生物量增殖倍数=（收获量鲜重—接种量鲜重）/接种量鲜重。 

将上述培养的荞麦愈伤组织细胞置于55℃的烘箱中烘干至恒重，并用分光光度法对荞麦组培物中黄酮含量进行检测，测定样品通过显色后在 500nm处直接测定吸光度，并计算出组培物中黄酮的含量。 

上述步骤（1）中所述消毒处理是指将苦荞茎段用浓度为0.1%的升汞消毒3～8分钟，再用无菌水清洗3～5次。 

上述步骤（1）中的苦荞茎段选用靠近苦荞麦植株顶芽端的幼嫩茎段。 

上述步骤（3）中的愈伤组织选择生长旺盛、质地较疏松且无褐变产生的愈伤组织。 

本发明是具有这样一个思路：由于黄酮的生物合成包含乙酸丙二酸途 径和莽草酸途径，而黄酮的A环是乙酸经乙酸丙二酸途径合成，因此，喂饲前体物乙酸钠是合成黄酮的直接前体，因而添加适宜浓度的乙酸钠，可以明显地提高荞麦悬浮培养细胞中次生代谢产物黄酮的合成。而饲喂的前体物酵母提取物，作为一种生物性诱导剂可通过活化苯丙烷类途径中的一系列关键酶，如苯丙氨酸解氨酶 ( PAL )、 肉桂酸 4-羟化酶 (CA4H)和香豆酸- CoA联结酶 (4CL)等能促使黄酮类化合物的积累。 

因此本发明采用前体饲喂技术，通过在苦荞麦茎段细胞的悬浮培养液中，添加乙酸钠或酵母提取物等黄酮合成类物质的代谢中间产物可有效提高苦荞麦培养细胞中的总黄酮含量，为进一步大规模开展荞麦植物次生代谢产物的生产奠定了基础，也为进一步研究荞麦植物中黄酮次生代谢的分子调控提供了重要的技术支持。 

具体实施方式

实施例1 

(1) 外植体的处理：选取生长健康和无病虫害的靠近苦荞植株顶芽端的第1～2个幼嫩茎段作为外植体，用浓度为0.1%的升汞消毒4分钟，再用无菌水清洗4次；