[发明专利]天然麝香的多肽电泳图谱检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药检测方法，具体涉及一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。

背景技术

麝香具有一定的抗炎镇痛药理活性，现有研究显示麝香的抗炎活性与麝香中特有的糖肽有关，不同文献报道其抗炎糖肽分子量各不相同，不同来源的麝香其多肽成分有显著性差异。常规的电泳分析体系Tris-甘氨酸-SDS-PAGE电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在10~200kDa，对于相对分子质量小于10kDa的多肽分辨率低。利用含有SDS的凝胶中加入高浓度脲时可利用SDS-PAGE对小分子多肽进行分析的分离效果不甚理想，且重现性较差，且小分子多肽在固定染色的过程中容易丢失。并且由于麝香样品蛋白含量较低，且麝香为贵重药材，在进行鉴别研究中不能采用先提取出其蛋白质成分，然后进行电泳检测的方法；另一方面，麝香样品提取物中含有大量的色素类成分，难以在微量样品检测中有效去除。研究中发现优化的人工麝香凝胶电泳方法不适用于天然麝香样品，故采用Tricine-SDS-PAGE电泳，建立麝香多肽电泳方法。

发明内容

本发明提供了一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备

称取天然麝香样品0.003~0.008重量份，加入1体积份乙醚，超声提取15~25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取15~25min，在4500rpm，10℃条件下离心15~25min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴3~8min，即得电泳样品；

2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法

（1）电泳溶液准备：

(a)去离子水溶解100~150重量份Tris，用HCl调PH值至7-9，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；

(b)去离子水溶解50~70重量份Tris，80~100重量份Tricine，3~8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；

(c)去离子水溶解150~200重量份Tris，1~2重量份SDS，用HCl调PH值至7~9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；

(d)40~60%丙烯酰胺，1~2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；

(e)40~60%丙烯酰胺，1~5%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；

(f)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10%SDS，0.6~1体积份β–巯基乙醇，0.5~1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；

(g)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10%SDS，0.6~1体积份β–巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；

（2）凝胶制备：

分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.2~0.6重量份甘油，0.5~1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份，临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；

夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)0.5~1.5体积份，0.5~0.8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份,临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；

浓缩胶2体积份：0.4~0.6体积份凝胶缓冲液(3×)，0.1~0.2体积份3C储液，去离子水稀释至1~3体积份，临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；

（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处

（4）染色方法

采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：

固定液：量取甲醇30-60体积份，冰醋酸5-20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；

染色液：称取0.5~1.0重量份AgNO₃溶于3~5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 15~30体积份，再加入氨水1~2体积份混匀，将制备好的AgNO₃溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；