[发明专利]一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用。 

背景技术

目前，我国水果采后腐烂损失严重，造成了巨大经济损失。采后病原微生物的侵染是造成采后腐烂损失的最主要原因。但是在水果保鲜中大量使用化学杀菌剂给水果的食用安全造成了很大的影响，如何减少水果保鲜中化学杀菌剂的使用成为公众十分关注的食品安全问题。 

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn是自然界中广泛的一种非致病细菌,能够分泌多种抗菌物质，其中抗菌蛋白或抗菌肽具有抑菌广谱性和高效性，对环境无污染、对人畜无毒无害、不产生抗药性等优点，在研究开发新型生物农药制剂中有广阔的利用价值。目前市场上的生物农药主要是以活菌体生物制剂为主，其在使用时常出现见效缓慢、防效也不稳定、易受紫外线影响等现象，并且在储藏过程中有效期较短，对储藏环境要求严格等。而抗菌蛋白或抗菌肽等生物农药则避免了外界环境对活菌体保存产生的影响，并且防效稳定、见效快。因此，抗菌蛋白或抗菌肽生物生物制剂比活菌体制剂更具有优势和应用前景。抗菌蛋白或抗菌肽的研究还能够为抗菌蛋白基因的克隆、转基因工程菌的构建，以及培育新的抗病品种打下良好的基础。 

李智洋等利用硫酸铵沉淀法从枯草芽孢杆菌代谢物中沉淀出抗软腐菌的抗菌蛋白。黄保全等利用硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析等方法从枯草芽孢杆菌E1R-j发酵液中分离纯化出抗菌蛋白j1。San-Lang Wang等也从枯草芽 孢杆菌W-18中提取出几丁质酶，分子量为20.6kD，能够强烈抑制Fusariumoxysporum生长的作用。Wiehitra L.等从枯草芽孢杆菌NSRS89-24中分离纯化出β-1,3-葡聚糖酶，β-1,3-葡聚糖酶可以催化β-1,3-葡聚糖多聚体水解，而达到抑制真菌生长的目的。 

发明内容

本发明为解决现在技术中的问题，提供一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用，它对果实和农作物病害也都有显著的防治效果，是一种广谱高效的蛋白制品。 

本发明采用以下技术方案予以实现： 

所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No.3665，菌种名称：枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis）J18。 

本发明一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白的制备方法，它包括以下步骤； 

J18抗菌蛋白的制备； 

种子活化：将枯草芽孢杆菌J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30℃、150-250rpm培养18h，得J18菌悬液；取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基中，于25℃培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，于30℃、150-250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30℃振荡培养，转速为150-250rpm；得活化的菌悬液。 

种子培养:将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150-250r/min，30℃摇床培养16h。 

发酵培养:使用30L发酵罐进行分批发酵；装料系数0.6(18L)，接种量5%，发酵温度30℃，通气量0.5m3/h，搅拌转速150-250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，pH 6.8~7.2，不流加调节pH值的酸碱性物质。 

发酵培养基配方为淀粉3g、蔗糖5g、硫酸锰30.8mg/kg的溶液2mL、磷酸 氢二钾3g、磷酸二氢钾1.5g、豆粕30g，水1000mL。 

发酵周期:34±2h。 

取菌株J18发酵上清液经0.22μm孔径的细菌过滤器过滤制成无菌滤液；取无菌滤液，采用(NH4)2SO4沉淀法提取，在硫酸铵梯度40-70%下，4℃下沉淀过夜，8,000r/min离心20min，沉淀用0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)悬浮，SepherdexG-25层析除盐，真空冷冻干燥，获得J18抗菌蛋白。 

所述LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和水1000mL。 

所述LB固体平板培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g和水1000mL。 

使用上述制备的J18抗菌蛋白制备的蛋白制品，所述蛋白制品为被膜剂或抗菌保鲜纸。 

所述被膜剂的制备方法包括以下步骤：