[发明专利]CFHR1基因型、高密度脂蛋白上CFHR1及氧化磷酸胆碱的测定试剂盒及测定方法

说明书

本发明要解决的技术问题是提供年龄相关性黄斑变性（AMD）疾病发生、发展的诊断试剂。本发明涉及对CFHR1基因型鉴定、血浆样品中CFHR1含量测定、高密度脂蛋白样颗粒上CFHR1结合量和CFHR1与氧化特异性抗原结合的试剂盒及其检测方法。本发明对年龄相关性黄斑变性（AMD）疾病发生、发展的诊断提供了可靠的参照指标。创造性地确认了不同基因型CFHR1。而本发明的工作可能会导致在预防和治疗老年黄斑退化的新策略，如通过CFHR1活性的抑制或对其下游的参与脉络膜形成炎症基因，包括IL‑1的活性抑制，以期能预防和治疗老年黄斑退化。具有广阔的开发应用前景。

技术领域

本发明涉及补体因子H相关蛋白1（CFHR1）的基因型鉴定，CFHR1在血浆中的测定方法，含CFHR1高密度脂蛋白样颗粒的分离纯化，CFHR1对氧化特异性抗原的结合，以及高密度脂蛋白（HDL）上氧化磷脂的检测，并且通过以上检测所得到的数据，对年龄相关性黄斑变性进行预警性诊断和治疗指导。具体涉及有关的定量检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病机理涉个体的遗传变异及环境危险因素（如氧化应激）的相互作用。AMD患者视力的严重损失大多是由于脉络膜新生血管（CNV）出血及渗出，或湿性AMD引起。AMD是老年人不可逆失明的主要原因并影响世界上数以百万的人。

全基因组关联研究（GWAS）可有效推进基于分子水平的复杂性状疾病¹的研究。但是，对遗传变异的性状与发病机制之间的理解仍需实质性的突破。现已发现AMD的发生与1号染色体上的补体因子H（CFH）区域密切相关。CFH区域包含两个主要疾病风险单体，一个由rs1061170（Y402H）标记，另一个由rs2274700^3-9标记。这两个风险单体型一起出现在60%以上的AMD患者中。

最近的研究发现，CFH相关蛋白（CFHRs）的拷贝数变异也与AMD相关。特别是，由rs6677604标记的CFHR1在高密度脂蛋白上的缺失与避免AMD^10,12病变有关。CFHR1基因位于1号染色体长臂31-32区域，其蛋白编码与CFH的C端具有高度同源性。CFHRs与补体系统中的其它具体效应因子相互结合起调节功能。

研究表明，许多老化疾病与氧化应激相关，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病和AMD^16,19。除了全身整体性的氧化应激，视网膜感光细胞同时还因为与局部氧化产物的接触所受到氧化应激。视网膜的感光细胞含有大量不饱和脂肪酸磷脂，如磷脂酰胆碱（PtC）等。这些磷脂是极容易受到氧化应激导致化学结构发生变化，产生各种氧化磷脂（oxPLs）。例如1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PAPC，1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）是最常见视网膜磷脂之一。在氧化作用下，其中的双键结构被打断，从而使磷酸胆碱（PC）基团产生构象变化，变为1-palmitoyl-2-(5'-oxo-valeroyl)-snglycero-3-phosphocholine（POVPC，1-棕榈酰-2-氧化戊酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）（图1）。POVPC可以由鼠天然抗体TEPC15（通常也叫T15）明确识别。相比之下，TEPC-15却不与正常细胞膜或天然脂蛋白上的非氧化卵磷脂结合20。通常，oxPLs存在于氧化修饰的低密度脂蛋白（oxLDL）载体或凋亡细胞上。很多研究已经表明oxPL能够刺激强烈的炎症反应，并且可以作为一个可靠的氧化应激生物标记物^21，22。

有研究人员发现，一部分的CFHR1存在于血浆中一种特殊的高密度脂蛋白样颗粒上。该颗粒包含载脂蛋白A（ApoAI）、脂多糖结合蛋白（LBP）和磷脂²³。由于此高密度脂蛋白样颗粒仅占小于HDL总量的1%，因此推测它不是脂质转运的结构组件。相反，它可能具有调节功能，可能是参与和细菌内毒素的结合来调节炎症反应。然而，CFHR1在此高密度脂蛋白样颗粒中的确切作用尚没有被充分探讨，尤其是在AMD的研究中。