[发明专利]一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途。

背景技术

近年来由于经济与利益的驱使，滥用抗生素和超标使用抗生素的现象普遍存在。随着抗生素广泛而长期的使用，其负面作用日益凸显，细菌的耐药性与药物残留严重威胁着人类健康，寻求抗生素替代品势在必行。我国现已开发了抗菌肽、益生素、糖萜素、低聚糖、中草药、酶制剂、酸化剂等绿色添加剂以替代抗生素。

抗菌肽是宿主免疫系统产生的一类非特异性的抵抗外界病原体感染的免疫应答产物，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。抗菌肽因其种类多，来源安全，抗菌活性高，抗菌谱广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，被认为是替代抗生素的理想药物。

菌丝霉素是从腐生子囊菌假黑盘菌（Pseudoplectania nigrella）分泌的一种抗菌肽，又称假黑盘菌抗菌肽，由于其独特的杀菌机制，使菌丝霉素具有细胞毒性和溶血性等危害，具有很大的药用潜力。然而，假黑盘菌中菌丝霉素的表达量低、分子小，分离困难，化学合成菌丝霉素成本高，所以利用分子生物学技术重组表达外源基因是获取目标蛋白的有效途径。

申请号：201010115167.4，发明名称：一种菌丝霉素基因及其原核融合基因工程菌的专利申请公开了一种重组菌丝霉素的制备方法及应用，该菌丝霉素的分子量为4401.9Da，其核苷酸编码序列如该申请中SEQ ID NO.1所示。管韬等，“菌丝霉素的串联表达及其菌内抑菌活性分析”，畜牧兽医学报，2012,43（4）：620-626公开了重组菌丝霉素的串联表达菌株，表达的融合蛋白的分子量为30、35和40KD，核苷酸编码序列的大小为135、261和387bp。王楠，“假黑盘菌素和T4溶菌酶微生物高效表达系统的建立”，中国农业科学院学位论文，2010年10期公开了在毕赤酵母细胞中表达和生产重组菌丝霉素的方法，其制备得到的稳定表达重组菌丝霉素的工程菌株PleI，在发酵条件优化的前提下，中试规模（50L发酵体系）时，重组菌丝霉素的表达量仅为0.14g/L，即140μg/ml。

现有技术中，研究者用不同的基因工程方法表达得到了重组菌丝霉素，但是表达水平均较低，难以实现工业化生产。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的重组抗菌肽——重组菌丝霉素，以及编码该重组抗菌肽的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的重组载体、工程菌，还提供了该重组抗菌肽的制备方法和用途。

本发明重组抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述重组抗菌肽的其核苷酸编码序列如SEQ ID NO.2。

本发明SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明重组载体，它包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述的重组载体优选为pET30a重组载体。

本发明重组菌，它包括前述的重组载体。所述重组菌优选为重组大肠杆菌。

本发明重组菌丝霉素的制备方法，它包括如下步骤：

（1）取前述重组菌，在大肠杆菌培养基中培养，诱导表达，离心，得菌体和发酵上清液；

（2）取步骤（1）所得菌体裂解，离心，得裂解上清液，与步骤（1）所得发酵上清液合并，分离纯化，即得。

优选地，所述步骤（1）中，大肠杆菌培养基为LB培养基，培养的条件是37℃、pH6.0、300r/min振荡培养，培养时间为3~18h，诱导表达使用的诱导剂是浓度为1.0M的IPTG。进一步优选地，所述培养时间为10h。

优选地，步骤（2）所述分离纯化采用GSTrap FF柱层析。

本发明最后提供了前述重组抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

本发明从天然菌丝霉素出发，用基因工程的方法制备得到了重组抗菌肽，该重组抗菌肽抗菌活性高，为临床抗菌药物提供了一种新的选择，并且，且本发明重组抗菌肽的制备方法简单，产量高，是现有重组菌丝霉素产量的12.8倍以上，经济效益巨大，工业应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明