[发明专利]抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及抗肿瘤基因工程抗体，更具体地，涉及抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物。

背景技术

CD47又称整联蛋白相关蛋白(integrinassociated protein，IAP)，其配体为信号调节蛋白α链(signal regulatory protein alpha，SIRPα)。CD47通过与SIRPα结合可产生抑制性信号来降低吞噬细胞(单核细胞及巨噬细胞)的吞噬活性，进而对免疫系统产生抑制作用。在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌等恶性疾病的研究中，发现肿瘤细胞存在CD47的升高，且CD47高表达提示临床预后不良，一些类型的肿瘤干细胞中亦存在CD47的过表达。肿瘤细胞借CD47-SIRPα通道，产生“别吃我”信号，从而逃避免疫系统的自我监测。使用抗CD47抗体，通过阻断CD47-SIRPα通道抑制细胞吞噬的作用，能够显著增强了机体免疫系统能力，达到抗肿瘤的目的。有文献表明使用抗CD47单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌等肿瘤也获得了一定的疗效。

共刺激分子B7/CD28在T淋巴细胞的激活方面有着重要的作用，他们可提供激活T淋巴细胞的正性信号来刺激T淋巴细胞分泌细胞因子、促进T淋巴细胞分化，同时也已证实CD28广泛表达于T淋巴细胞。CD28与APC上的B7结合后，为T淋巴细胞提供共刺激信号。它们的结合对初次免疫应答的诱导是必需的，主要涉及树突状细胞与T淋巴细胞相互作用的起始阶段，该信号修饰和补充TCR信号，并将多种信号整合后，起着信号传递、增强或放大免疫应答的作用，因此可以利用B7/CD28的这一性质来促进免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。有文献表明B7-FC融合蛋白同样可以有效激活、增强T淋巴细胞的免疫功能。

目前已经出现的一些抗肿瘤抗体主要是通过单独与CD47结合，或者单独与CD28结合，通过增强机体免疫系统能力，达到抗肿瘤的目的。但是单一结合位点与肿瘤细胞的特异性结合作用有限，对肿瘤的防治效果不明显。SIRPα分子具有高度的亲嗜性，可选择性地与肿瘤细胞CD47分子结合，共刺激分子B7可选择性地与T淋巴细胞CD28分子结合，本发明的二价类抗体同时具有上述可分别与肿瘤细胞上的CD47位点和T淋巴细胞上的CD28位点特异性结合的SIRPα和B7，特异性结合作用显著增强，可以实现双重增强机体清除肿瘤细胞的能力。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中的抗肿瘤抗体与肿瘤细胞的特异性结合作用有限、对肿瘤的防治效果不明显的缺陷，提供一种可同时与肿瘤细胞和T淋巴细胞特异性结合、有效预防和治疗肿瘤感染的抗肿瘤基因工程二价类抗体及抗肿瘤基因工程药物。

本发明的另一目的在于，提供一种工艺简单、便于实施的上述抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种抗肿瘤基因工程二价类抗体，所述二价类抗体包括两个可变区和将所述两个可变区连接在一起的恒定区，所述两个可变区分别为SIRPα和B7；所述恒定区为柔性连接肽、或者所述恒定区为人抗体的恒定区。

在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体中，所述柔性连接肽具有序列表中的SEQ ID No：16所示的氨基酸序列，所述人抗体的恒定区为具有激活人体免疫功能的抗体Fc片段。

在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体中，所述人抗体的恒定区为IgG抗体的恒定区、IgA抗体的恒定区或IgM抗体的恒定区。

在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体中，所述SIRPα和所述B7分别通过柔性连接肽与所述人抗体的恒定区柔性连接，所述柔性连接肽具有序列表中的SEQ ID No：16所示的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供一种上述抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：

A：分别获取恒定区基因、SIRPα基因和B7基因；

B：当所述恒定区基因为人抗体的恒定区基因时，采用真核表达载体构建包括人抗体的恒定区基因、SIRPα基因和B7基因的表达质粒；

或者，当所述恒定区基因为柔性连接序列时，采用原核表达载体或所述真核表达载体构建包含柔性连接序列、SIRPα基因和B7基因的表达质粒；

C：将步骤B中形成的表达质粒转染至表达细胞株中进行培养，稳定表达二价类抗体；

D：离心收集上清或细胞进行纯化后得到所述二价类抗体。