[发明专利]一种高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人脐带血间充质干细胞高效分离及培养的方法。

背景技术

干细胞是指生物体内能够进行自我更新，并维持机体各组织细胞新陈代谢的一群细胞。同时,在生物体内各种组织受到内源或外源性的损害时,干细胞可以被激活执行分化功能,从而达到修复该组织的目的。间充质干细胞在适当的条件下,具有强大的增值能力和分化能力,能够修复多种组织损伤,包括骨骼，肌肉，神经等组织，因此，间充质干细胞在再生医学治疗领域引起了越来越多的重视。

骨髓当中含有丰富的间充质干细胞,因此得到了最为广泛和深入的研究.研究证实,骨髓间充质干细胞表达特定的表面抗原表型,比如,CD45^-,CD34^-,CD29⁺,CD90⁺,CD73⁺和CD105⁺。在体外和体内环境中可向骨骼，软骨，神经以及胰岛等细胞分化。另外，骨髓间充质干细胞具有免疫调节的功能，分泌多种免疫相关信号分子，从而在免疫性疾病治疗过程中发挥作用。但是，尽管骨髓间充质干细胞细胞较易分离和培养,但是,骨髓来源有限,难以满足临床大量的需求.即便是进行病人的自体移植,患者也必须承担额外的痛苦。在其他组织，比如肌肉，脂肪，脑以及脐带血等其它组织也能分离获得间充质干细胞。这些细胞有与骨髓间充质干细胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去脐带血外，应用其他组织的间充干细胞面临着和应用骨髓间充质干细胞相同的问题，及样品稀缺，不足以满足临场需求。

脐带血是指早产或正常分娩婴儿脐带内的血液。已经证实，脐带血种含有活性很强的干细胞群，包括造血干细胞和间充质干细胞。脐带血中的间充质干细胞与骨髓干细胞相似，有着相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文献表明，脐带血干细胞有着更原始的干细胞特性和更低的免疫原性。同时，应用脐带血治疗糖尿病，神经损伤以及血管坏死等疾病也屡见报道。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法，通过获取脐带血，利用特定的细胞粘附蛋白而不是使用成分难以确定的细胞外基质，对其中的间充质干细胞进行分离纯化，并配合适当的培养基，实验对脐带血的高效扩增。

技术方案：本发明的高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法具体为：

a.收集脐带血样品：所述脐带血样品自医院采集，或自脐带血库中获取的人脐带血样品，在无菌条件下获取正常或早产胎儿的脐带血,肝素抗凝；

b.分离脐带血中单核细胞成分：所述脐带血血样品均应经过肝素抗凝，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种；脐带血间充质干细胞的分离纯化过程在分娩后24小时内进行；

c.将单核细胞成分接种于包被蛋白基质成分的培养皿：包被蛋白基质指层连蛋白和明胶蛋白按体积比1：2混合；

d.分离间充质干细胞：细胞接种于上述包被的细胞培养板后，使用脐带血间充质干细胞培养基培养，及时除去未贴壁细胞并更换培养基，此时，脐带血间充质干细胞得到分离；

e.培养和扩增间充质干细胞：继续使用脐带血间充质干细胞培养基培养，每5-8天换液一次，直至细胞为80-95%融合；细胞用胰酶进行消化，接种于一般培养板，使用脐带血间充质干细胞培养基继续培养，2-4天换液一次，直至融合，并进行下一次传代，实现间充质干细胞的扩增。

其中所述脐带血间充质干细胞培养基其中包括：α-MEM，Pen-Strep，b-FGF,EGF,TGF-β；其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子,TGF-β为转化生长因子。

该方法包括：首先使用同体积α-MEM稀释抗凝过的脐带血，与4-6g/L的甲基纤维素按体积比4:1混合，静置20-40分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度在1-1.1范围的淋巴细胞分离液上，在2000-3000转/分钟离心15-30分钟，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤。将细胞加入用层连蛋白和明胶蛋白包被的细胞培养板上；细胞在α-MEM中培养，该培养基中含有Pen-Strep，b-FGF,EGF,TGF-β添加成分，细胞达到80-95%融合时，进行传代；传代时，使用普通培养皿，并在上述含有添加成分的培养基中进行细胞的扩增。