[发明专利]一种高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于该方法为：

a.收集脐带血样品：所述脐带血样品自医院采集，或自脐带血库中获取的人脐带血样品，在无菌条件下获取正常或早产胎儿的脐带血,肝素抗凝；

b.分离脐带血中单核细胞成分：所述脐带血血样品均应经过肝素抗凝，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种；脐带血间充质干细胞的分离纯化过程在分娩后24小时内进行；

c.将单核细胞成分接种于包被蛋白基质成分的培养皿：包被蛋白基质指层连蛋白和明胶蛋白按体积比1：2混合；

d.分离间充质干细胞：细胞接种于上述包被的细胞培养板后，使用脐带血间充质干细胞培养基培养，及时除去未贴壁细胞并更换培养基，此时，脐带血间充质干细胞得到分离；

e.培养和扩增间充质干细胞：继续使用脐带血间充质干细胞培养基培养，每5-8天换液一次，直至细胞为80-95%融合；细胞用胰酶进行消化，接种于一般培养板，使用脐带血间充质干细胞培养基继续培养，2-4天换液一次，直至融合，并进行下一次传代，实现间充质干细胞的扩增。

2.根据权利要求1所述的高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于其中所述脐带血间充质干细胞培养基其中包括：α-MEM，Pen-Strep，b-FGF，EGF,TGF-β；其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子,TGF-β为转化生长因子。

3.根据权利要求1所述的高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于该方法包括：首先使用同体积α-MEM稀释抗凝过的脐带血，与4-6g/L的甲基纤维素按体积比4:1混合，静置20-40分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度在1-1.1范围的淋巴细胞分离液上，在2000-3000转/分钟离心15-30分钟，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤。将细胞加入用层连蛋白和明胶蛋白包被的细胞培养板上；细胞在α-MEM中培养，该培养基中含有Pen-Strep，b-FGF,EGF,TGF-β添加成分，细胞达到80-95%融合时，进行传代；传代时，使用普通培养皿，并在上述含有添加成分的培养基中进行细胞的扩增。