[发明专利]从海藻提取物中纯化岩藻依聚糖的工艺方法

说明书

本申请是申请日为2008年2月1日，发明名称为“从海藻提取物中纯化岩藻依聚糖的工艺方法”的中国专利申请号200880007955.2的分案申请。

技术领域

本发明通常涉及岩藻依聚糖(本文也称为AV513)的生产。更具体地说，本发明涉及纯化岩藻依聚糖提取物以除去重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质但不影响期望的生物学活性的方法。

背景技术

正常的凝血是一个复杂的生理和生化过程，其在几个水平上受到调节。凝血过程涉及凝血因子级联系统的激活，产生纤维蛋白和导致血小板聚集以及血管收缩(Davie等人的综述，Biochemistry30：10363，1991)。凝结级联系统由“外源性”途径和“内源性”途径构成，外源性途径被认为是引发正常凝血的主要手段，内源性途径则扩展凝血反应。出血损害的正常反应包括激活外源性途径。当血液接触受伤后被暴露于组织上或在组织上表达的组织因子(TF)-因子VII的辅因子时，引发外源性途径的激活。TF与促进产生FVIIa的FVII形成复合体。FVIIa接着结合TF将FX转化为丝氨酸蛋白酶FXa，这是凝血酶原复合物的关键成分。通过FXa/FVa/钙/磷脂复合物将凝血酶原转化为凝血酶刺激了纤维蛋白的形成和血小板的活化，所有这些都是正常凝血所必需的。内源性的途径因子IXa和VIIIa进一步增强正常的止血，这两个因子也可以将FX转化为FXa。也可以见Weitz，J.I.，等人，Chest，126(3)，September2004(Suppl)，265S。

硫酸多糖是一类动物和人类中以许多生物学活性为特征且具有良好耐受性的分子。这些聚阴离子分子通常来自植物和动物组织，并且包括广范围的亚类，包括肝素、葡糖氨基聚糖、岩藻依聚糖、交叉菜聚糖、多硫酸戊聚糖(pentosanpolysulfates)和硫酸皮肤素或硫酸葡聚糖。肝素样的硫酸多糖显示通过抗凝血酶III和/或肝素辅因子II相互作用介导的不同抗凝血活性(Toida TC，Linhardt，RJ.，Trends in Glycoscience and Glycotechnology2003；15：29-46)。

尽管有这样的一种硫酸多糖-口服肝素已被考虑作为一种抗凝血剂开发(ADunn，Idrugs，3：817-824，2000)，但是只有肝素是不够的，因为其具有严重的并发症，这些并发症包括术中和术后出血、骨质疏松、脱发、肝素抗性、肝素反跳、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症血栓形成综合症(HITTS)以及其他的缺点，包括中断给药几天后抗凝血作用衰减(Iqbal O等人，FareedJ，Expert Opin Emerg Drugs6：111-135，2001；Roberts，HR，Anesthesiology100：722-730，2004)。肝素通常胃肠外给药，其口服吸收水平只有大约1％(Fitton，J.H.，Glycoscience，The Nutrition Science Site，modified January01，2005)。

与肝素相反，另一种硫酸多糖，岩藻依聚糖，其从海藻分离出来，已经证明能够调节(即加速)凝血(美国专利号2005/0282771)。具体地说，当在体外以低浓度给药或在体内以低的皮下剂量给药时，岩藻依聚糖通过外源性途径途径激活血友病情形下的凝血(Liu，T等人，和Johnson，K.W.，Thrombosis andHaemostasis，95：68-76，2006)，这证实了其促凝血活性。更高剂量的岩藻依聚糖能够具有与肝素相似的抗凝血活性。鉴于目前的抗凝血剂如肝素或苄丙酮香豆素(warfarin)的相关问题，因此明确地需要能够克服与目前存在的抗凝血治疗相关的一个或多个问题的药物如岩藻依聚糖。

由此，需要一种改进的方法，以经济划算和有效地生产具有最佳活性的富含岩藻依聚糖的提取物，用于促凝血剂或用于抗凝血治疗应用。

发明内容

本发明基于从海藻提取物纯化岩藻依聚糖的方法中获得的发现。该方法提供高产率的岩藻依聚糖，该岩藻依聚糖基本不含有重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质。

因此，本发明包括从非均相混合物富集岩藻依聚糖的方法，所述方法包括：

(a)提供岩藻依聚糖源；

(b)通过用螯合剂处理除去上述源中的重金属离子，产生第一岩藻依聚糖混合物；

(c)选择性沉淀所述第一岩藻依聚糖混合物中的岩藻依聚糖，除去污染物；

(d)在水溶液中重悬含有岩藻依聚糖的沉淀物，获得第二岩藻依聚糖混合物；