[发明专利]DC-CIK细胞分离培养试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于分离和培养DC-CIK细胞的试剂盒及其应用。

背景技术

以肿瘤免疫治疗为核心的生物治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第四种治疗模式。该治疗模式是采用患者自体免疫细胞进行诱导，刺激或辅助人体自身免疫系统，从而完善和增强患者的免疫机能，且治疗手段安全，基本无毒副作用，因此于近年来显示出良好的应用前景。

DC-CIK联合治疗是目前肿瘤生物治疗中最成熟的治疗方案之一。DC（树突状细胞）是迄今发现的功能最强大的抗原提呈细胞，可高效准确识别肿瘤抗原并将信息传递给人体免疫系统，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用；DC主要由骨髓中的髓样干细胞和淋巴样干细胞分化而来，数量较少，仅占外周血单核细胞数量的1%以下。CIK 细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）是一种新型免疫活性细胞，兼有T淋巴细胞的强大抗肿瘤活性和NK细胞（自然杀伤细胞）的非主要组织相关性复合物限制性杀瘤的特点，对肿瘤细胞的杀伤活性可达84.7% ；CIK细胞主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+ T细胞亚群组成，其中CD3+CD56+ T细胞为自然杀伤活性T细胞（NKT细胞），在正常人外周血中含量极少，具有抗肿瘤活性，CD3+CD8+  T细胞为细胞毒性T细胞（CTL细胞），是体内执行细胞免疫功能的主要效应细胞。DC和CIK细胞共同培养联合应用不仅可显著增强CIK的抗肿瘤活性，还可提高CIK对肿瘤靶细胞杀伤作用的特异性。DC-CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高等优势，可在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下直接杀伤肿瘤细胞，并且具有调节和增强机体免疫的功能，尤其是对手术和放化疗后的患者效果更为显著，能消除患者机体微小的残留或转移性病灶，防止癌细胞的扩散和复发，对改善患者生活质量以及提高患者生存率具有重要意义，是现今肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

DC和CIK细胞尚不能直接从组织中大量分离获得，必须经过培养扩增并纯化后才能满足临床应用的需求。目前，国内DC-CIK细胞的分离和培养技术主要存在以下缺点：

（1）分离获得的DC和CIK细胞纯度和活性较低。国内主要采用淋巴细胞分离法，分离得到的DC和CIK细胞纯度和活性普遍较低，其中还混杂有较多的红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、血小板等，当细胞碎片回输入人体后易引发病人出现发热、炎症等不良反应。

（2）CIK细胞增殖速度慢，数量少。国内现有技术培养的CIK细胞其增殖速度慢，难以达到肿瘤治疗所需数量级，肿瘤治疗效果欠佳。

（3）CIK细胞有效抑瘤因子表达水平低。CIK细胞的细胞毒性与CD3+CD56+的表达水平呈正相关，而国内现有技术培养的CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞比例低，双阳性表达率不足10%。 

发明内容

本申请人针对现有DC-CIK细胞分离和培养技术存在的上述缺陷，经过研究改进，提供一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒；本发明的另一个目的在于提供上述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒，包括：

（1）淋巴细胞分离液；

（2）外周血样处理液：包括含有质量百分浓度为1~3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；

（3）CIK细胞诱导增殖体系：包括CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2；

（4）DC诱导增殖体系：包括GM-CSF和白细胞介素-4；

（5）细胞培养瓶包被体系：包括纤粘连蛋白和γ干扰素；

（6）淋巴细胞培养基GT-T551；

（7）细胞培养袋。

本发明还提供了一种上述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，具体步骤如下：

   （1）外周血样单核细胞的分离：取新鲜的人外周血样，在其中加入血液抗凝剂后制得抗凝血样；向所述抗凝血样中加入1/3~2/3体积的所述外周血样处理液，充分混匀，用1~1.5倍体积的所述淋巴细胞分离液分离所得混合液中的单个核细胞，并用所述淋巴细胞培养基GT-T551调节所述单个核细胞密度至1~5×10⁶个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所述外周血单核细胞悬液用所述外周血样处理液洗涤，于室温离心5~10 min，转速1500~2000r/min，取白膜层细胞；

（2）DC和CIK细胞的分离：