[发明专利]DC-CIK细胞分离培养试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒，其特征在于包括：

（1）淋巴细胞分离液；

（2）外周血样处理液：包括含有质量百分浓度为1~3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；

（3）CIK细胞诱导增殖体系：包括CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2；

（4）DC诱导增殖体系：包括GM-CSF和白细胞介素-4；

（5）细胞培养瓶包被体系：包括纤粘连蛋白和γ干扰素；

（6）淋巴细胞培养基GT-T551；

（7）细胞培养袋。

2.权利要求1所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于具体步骤如下：

   （1）外周血样单核细胞的分离：取新鲜的人外周血样，在其中加入血液抗凝剂后制得抗凝血样；向所述抗凝血样中加入1/3~2/3体积的所述外周血样处理液，充分混匀，用1~1.5倍体积的所述淋巴细胞分离液分离所得混合液中的单个核细胞，并用所述淋巴细胞培养基GT-T551调节所述单个核细胞密度至1~5×10⁶个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所述外周血单核细胞悬液用所述外周血样处理液洗涤，于室温离心5~10 min，转速1500~2000r/min，取白膜层细胞；

（2）DC和CIK细胞的分离：

 向步骤（1）所得白膜层细胞中加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，将所得细胞混悬液接种至所述纤粘连蛋白预包被的细胞培养瓶，为瓶A，并于细胞培养箱中进行细胞培养；1~5h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至所述γ干扰素预包被的细胞培养瓶，为瓶B；

   （3） DC细胞的诱导增殖：

向瓶A中的贴壁细胞加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为500~750U/mL的所述GM-CSF以及终浓度为500~1000U/mL的所述白细胞介素-4，于细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次含有5~10%自体血浆的所述淋巴细胞培养基GT-T551，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4；5~7天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，8~10天后收获细胞，即得DC细胞；

（4）CIK细胞的诱导增殖：

向瓶B中加入含有5~10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为300~500μg/mL的所述CD3、终浓度为100~300U/mL的所述白细胞介素-1以及终浓度为5000~7500U/mL的所述白细胞介素-2，于细胞培养箱中进行细胞培养； 48~72 h后，换用含有5~10%自体血浆以及终浓度为500~750万U/L所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551继续培养；8~10天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，14~16天后收获细胞，即得CIK细胞； 

（5）DC与CIK细胞的共培养：

 将步骤（3）所得DC细胞和步骤（4）所得CIK细胞按照细胞数量比1:5~1:8的比例混合培养，得到DC-CIK细胞；

所述自体血清分离自添加了血液促凝剂的所述人外周血样；

所述自体血浆分离自步骤（1）所制抗凝血样；

以上百分含量如无特殊说明均为体积百分含量。

3.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养

DC-CIK细胞中的应用，其特征在于：步骤（3）所述扩大培养是在所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

4.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于：步骤（4）所述扩大培养是在含有5~10%所述自体血浆以及终浓度500~750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。

5.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于：步骤（5）所述混合培养是在含有1~5%所述自体血浆以及终浓度500~750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。