[发明专利]以三酶电化学生物传感器测定纤维素酶活力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水解酶催化活力的方法。具体是涉及采用溶液中的纤维素酶、葡萄糖氧化酶(GOx)和固定的辣根过氧化物酶(HRP)的三酶生物传感器对纤维素酶的催化活力进行连续监测的工艺方法。

背景技术

纤维素是储量丰富，占植物碳含量的50％以上。现已广泛运用到了纺织、造纸、食品、建筑、聚合物材料合成等领域。在能源紧缺和要求降低碳排放的今天，将纤维素这种可再生资源转化为新的能源又重新受到了人们的瞩目[李燕红，赵辅昆.生命科学2005，17：392-397]。

水解纤维素需要纤维素酶的参与。纤维素酶广泛存在于生物体中，一般使用的纤维素酶来自真菌，较为典型的真菌是曲霉属、木酶属和青霉属。

纤维素酶是一种多组分的酶系，底物也相对复杂。纤维素酶含有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。内切葡聚糖酶水解纤维素多糖链中的不规整区域，生成长短不一的寡聚糖；外切葡聚糖酶作用于纤维素多糖链的末端，生成葡萄糖或二糖；而β-葡萄糖苷酶则进一步水解二糖，产生葡萄糖。总体效果是将纤维素多糖链被水解成葡萄糖。

内切葡聚糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成新的自由末端，然后由外切葡聚糖酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将二糖水解葡萄糖。

目前，测定纤维素酶活力的方法是采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)的比色测定[颜秋生，蒋传葵.遗传，1979，3：33-34]，原理是利用纤维素酶催化水解纤维素，所产生的还原糖与DNS显色反应，由此推出还原糖的浓度，并由还原糖的浓度变化的速率求出酶的活力。该方法难以应用到有色的底液溶液中，而且灵敏度不够高。

以往，电化学传感器基本上是用于微量底物浓度的测定[Wang J.Chem.Rev.2008，108：814-825]。利用纤维素酶催化纤维素的水解可产生葡萄糖这一特点，人们尝试将葡萄糖电极用于纤维素酶活力的测定[Hildén L，et al.Anal.Biochem.2001，290：245-250；干宁等.纤维素科学与技术，2007，15：30-35；Cruys-Bagger N，et al.Biotechnol.Bioeng.2012，doi：10.1002/bit.24593]，得到了一种较为灵敏的纤维素酶活力实时检测方法。例如干宁等人的方法是用TiO₂凝胶膜将GOx酶固定于电极表面上，用二茂铁六氟磷酸盐作为电子媒介体。通过测量电极表面的葡萄糖浓度来确定纤维素的活力。

为了进一步提高测量的灵敏度，本发明将GOx酶溶解在溶液中，而不是固定在电极表面上。在电极表面的固定酶选用了活力较高的HRP酶。这样，溶液游离的纤维素酶和GOx酶，以及固定化的HRP酶构成了一种三酶电化学传感器。由于HPR酶和GOx酶的活力高于纤维素酶，所以酶传感器能够灵敏地测量纤维素酶活力的变化。

发明内容

本发明的目的之一是设计一种三酶电化学传感器。

本发明的目的之二是为不间断检测水解酶的活力提供一种实验方法。

本发明将纤维素酶和葡萄糖氧化酶溶于电解液中，HRP酶则固定在电极表面，在固液两相中存在着三种酶。所检测的纤维素酶是在溶液中处于游离状态的。其中的化学原理可简述为，在传感器体系中，纤维素大分子在纤维素酶的催化下被水解为小分子葡萄糖。葡萄糖进一步被溶液中的GOx酶氧化成葡萄糖酸，同时释放H₂O₂。H₂O₂将固定在电极上的HRP酶氧化成HRP中间体I和II。这两个HRP酶氧化中间体将氢醌分子氧化成苯醌。苯醌分子在电极上得到电子重新还原，从而在电极产生电流(附图1)。这一反应序列是化学计量的，电流能够敏感地反映出H₂O₂、葡萄糖和纤维素的即时浓度，并且与纤维素酶、GOx酶和HRP酶的活力有关。在GOx酶和HRP酶的催化能力高于纤维素酶时，电流反映了纤维素酶的相对活力。

具体工艺如下：

电化学传感器采用三电极系统：玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，甘汞电极(SCE)为参比电极。

将HRP酶与牛血清白蛋白(BSA)混合，继而将其附着在玻碳电极上，以戊二醛使BSA交联成膜。将酶修饰后的工作电极浸入到电解液中，同时浸入对电极和参比电极。加入微量的纤维素，使电化学工作站在-0.4～0.2V的电压范围内进行循环伏安扫描，以确定传感器的还原峰值电压。