[发明专利]一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，属于基因工程蛋白质技术领域。

背景技术

膜蛋白在生命活动中承担着重要的生物学功能，包括信号传导，物质运输和能量代谢的各个方面。由于膜蛋白特殊的结构和功能，它们成为了多种药物作用的主要靶点。虽然跨膜蛋白有着如此重要的生物学功能，但是由于其丰度低、疏水性强，具有微观不均一性，分离纯化天然膜蛋白并做结晶具有很大的难度。 因此，利用基因工程方法表达重组膜蛋白仍然是研究膜蛋白的另一条有效的途径。大肠杆菌是膜蛋白表达尝试中最常用的表达宿主，通过对表达载体、宿主菌、培养基和表达条件的筛选，获得膜蛋白的成功表达是膜蛋白研究中极为关键的一步。然而，目前天然膜蛋白表达量低，纯化困难等，本发明利用基因工程的方法构建了重组菌，诱导的重组蛋白经镍离子亲和层析柱一步纯化等简易的技术可以得到纯度较高的重组蛋白，克服了天然膜蛋白面临的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a- Bm-MMgT，诱导表达得到大量重组目的蛋白，然后经30mM、50mM浓度的咪唑水溶液洗掉未结合的蛋白，200mM浓度的咪唑水溶液洗脱重组目的蛋白，可以得到纯度较高的重组目的蛋白。

为达到上述目的，本发明提供一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，包括以下步骤：

(a) Bm-MMgT基因的合成；

(b)分别双酶切Bm-MMgT基因和载体，连接构建重组表达载体；

(c)转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白；

(d)纯化所得重组目的蛋白。

优选地，其中所述步骤(a) 具体包括：

(1)设计上游引物F: 5’-CTGGAATTCATGGCTTCATTTC-3’ (下划线为 EcoRⅠ位点)

下游引物R: 5’-CAGCTCGAGTCATTCTAGATTTTCTAG-3’(下划线为XhoⅠ位点)； 

(2)以家蚕蚕蛹cDNA为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为：95℃预变性5min，95℃变性35s，52℃退火35s，72℃延伸40s，循环30次；最后72℃延伸5min，回收产物；

(3)以步骤(2)的回收产物为模板，用所设计引物F2和R第2次扩增目的片段，具体程序同上，最后回收产物，得到Bm-MMgT基因。

优选地，其中所述步骤(b) 具体包括：

Bm-MMgT基因和pET-32a载体利用EcoRⅠ和XhoⅠ同时进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high进行连接30min并转化E.coli TG1感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT。

优选地，其中所述步骤(c) 具体包括：

将重组好的表达载体转化至E.coliBL21中，在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃，220 rpm振荡培养至OD600=0.5，加入终浓度为1 mM 的IPTG，37℃诱导表达5h，得到重组目的蛋白。

优选地，其中所述步骤(d) 具体包括：

(1)将得到的可溶的重组目的蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，用浓度为20Mm、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑水溶液进行洗涤；

(2)经洗涤条件的摸索(取10ml的上清液与2ml的镍离子亲和层析柱填料结合，室温孵育1h，以步骤(1)中所述的咪唑浓度进行洗脱，每个浓度洗涤20ml，其中上述上清液为所述步骤(c)所得重组目的蛋白经超声(超声功率为60%，超声总时间为4s，停3s，超1s)破碎后，12000rpm离心后的上清液，用浓度为30mM、50mM的咪唑水溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液洗脱重组目的蛋白。 

优选地，其中所述方法在步骤(a)之前还包括：

经家蚕蚕蛹cDNA文库筛选，筛选出一条家蚕膜镁转运蛋白(Bm-MMgT)，经TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对该蛋白进行跨膜分析，发现此蛋白是含有一个跨膜区的膜蛋白(是为了预测BmMMgT基因表达出的蛋白是一个一次跨膜蛋白)。