[发明专利]一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法

权利要求书

1.一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) Bm-MMgT基因的合成；

(b)分别双酶切Bm-MMgT基因和载体，连接构建重组表达载体；

(c)转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白；

(d)纯化所得重组目的蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a) 具体包括：

(1)设计上游引物F: 5’-CTGGAATTCATGGCTTCATTTC-3’，其中下划线为 EcoRⅠ位点；

下游引物R: 5’-CAGCTCGAGTCATTCTAGATTTTCTAG-3’，其中下划线为XhoⅠ位点； 

(2)以家蚕蚕蛹cDNA为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为：95℃预变性5min，95℃变性35s，52℃退火35s，72℃延伸40s，循环30次；最后72℃延伸5min，回收产物；

(3)以步骤(2)的回收产物为模板，用所设计引物F2和R第2次扩增目的片段，具体程序同上，最后回收产物，得到Bm-MMgT基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b) 具体包括：

Bm-MMgT基因和pET-32a载体利用EcoRⅠ和XhoⅠ同时进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high进行连接30min并转化E.coli TG1感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT通过质粒提取试剂盒提取。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c) 具体包括：

将重组好的表达载体转化至E.coli BL21中，在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃，220 rpm振荡培养至OD600=0.5，加入终浓度为1 mM 的IPTG，37℃诱导表达5h，得到重组目的蛋白。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d) 具体包括：

(1)将得到的可溶的重组目的蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，用咪唑水溶液进行洗涤；

(2)经洗涤条件的摸索，用浓度为30mM、50mM的咪唑水溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液洗脱重组目的蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中咪唑水溶液的浓度为20Mm、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中洗涤条件的摸索的具体操作为：取10ml的上清液与2ml的镍离子亲和层析柱填料结合，室温孵育1h，以所述步骤(1)中所述咪唑水溶液的浓度进行洗脱，每个浓度洗涤20ml；其中上述上清液为所述步骤(c)所得重组目的蛋白经超声破碎后，12000rpm，室温离心后的上清液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中超声功率为60%，超声总时间为4s。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(a)之前还包括：

经家蚕蚕蛹cDNA文库筛选，筛选出一条家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT，经TMHMM服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM对该蛋白进行跨膜分析，得知此蛋白是含有一个跨膜区的膜蛋白。