[发明专利]一种脂联素受体配基及激动剂的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂联素受体配基的筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

脂肪组织（adipose tissue）主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，在体内有6种存在形式：gAPN、fAPN、LMW、MMW、HMW和Alb-LMW。其中，fAPN是其它各种形式的组成的基本单位，而LMW、MMW、HMW是fAPN的寡聚体，gAPN是fAPN的球形部分。脂联素是一种胰岛素增敏激素(AnInsulin-sensitizing Hormone)，能改善小鼠的胰岛素抗性(Insulin resistance)和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。

脂联素有2种受体:AdipoR1和AdipoR2。全身各组织均可见AdipoR1表达,以骨骼肌表达最丰富，AdipoR2则在肝脏表达最丰富。AdipoR1对gAd是一种高结合力受体,而对全长型为低结合力受体；AdipoR2对两种脂联素都是中等结合力,受体和脂联素的相互作用,增加AMPK和过氧化体增殖物激活型受体α(peroxisome proliferator activated receptor,PPARα)配体活性,增加由脂联素所致的脂肪酸氧化和葡萄糖摄取。

脂联素与脂联素受体结合后，在锚定蛋白（APPL）的配合下，通过AMPK，MAPK以及PPAR通路调节一氧化氮的释放、葡萄糖的摄取、脂肪酸的β氧化、细胞因子如TNF-α的分泌等一系列作用发挥抗炎、抗糖尿病以及动脉粥样硬化作用。从脂联素的作用机制来看，对其信号通路的干扰主要有AdipoR，AMP/MAPK,Sirt1等几个潜在靶点，最有希望的是脂联素受体（AdipoR1和AdipoR2），激活受体可以发挥与脂联素相似的药理学效应。因此，寻找脂联素受体的配基及其激动剂显得尤为重要。

目前，国内外关于脂联素及其受体的研究数以千计，近十年来研究尤为迅速，但关于脂联素受体配基的筛选尚无任何报道。

基于荧光技术的检测分析方法是近年来被应用于药物高通量筛选的重要方法之一，目前应用于HTS的荧光技术包括均相时间分辨荧光分析法、荧光共振能量传递分析法、荧光关联光谱法和极化荧光分析法。其中，用极化荧光分析法高通量筛选药物时，生物分子之间相互作用后不用过滤分离游离（未结合）的荧光标记物，检测极方便。极化荧光方法的理论是基于分子在均相溶液中的自由旋转，当一个荧光标记分子被一个平面的极化光所激发时，其发射光可发射到一个固定的平面，而该发射光的极化水平与分子的旋转速度成反比，小分子旋转速度快，其极化值小，大分子旋转速度慢，其极化值大。基于该理论，用荧光物质标记生物分子，当分子之间由于结合或解离，分子的体积或分子量发生变化时，引起的荧光信号反映的极化值发生变化，所以，可根据极化值的变化情况，考察分子之间的结合和解离。

因而，从理论上说，所有分子的配基均可以用极化荧光方法检测出来，然而，实际情况却并非如想象的容易，该方法受到许多因素，如，荧光素分子的大小、荧光素标记位置、寿命长短、荧光素与受体蛋白的亲和度等许多因素的影响，找到恰当的极化荧光分子标记物，特异、灵敏地筛选目标分子的配基存在极大困难。

筛选得到目标分子的配基以后，如何简便有效地确定配基为拮抗剂或者为激动剂也是未解决的问题。现有文献一般在进行基于极化荧光的高通量筛选后声称得到待选的“拮抗剂”，实际上是偷换概念，并不准确，因为“拮抗剂”一定是配基，但是配基不一定是“拮抗剂”；配基也可能是“激动剂”。正确的实验方法应该是进行第二次实验对初筛样品进行复筛，现有文献所记载的复筛主要为western blotting技术，或者IP（免疫沉淀）技术。但是，这些技术具有很多的局限性，比如，一次可以处理的样品极其有限（每块胶最多可以上8-12个样品），再如该技术的实验时间长，从实验开始到得到数据（8-12个样品）需要至少一个星期，并且，大多数情况下只能再次证明这些样品为“配基”，成本高，有效性低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种脂联素受体配基和激动剂的筛选方法。

本发明脂联素受体配基的筛选方法，采用极化荧光技术筛选脂联素受体配基。

其包括如下步骤：

（1）取脂联素用荧光分子标记，将脂联素受体与荧光标记的脂联素混合，得混合溶液；