[发明专利]一种复合人的骨髓间充质干细胞的甲壳素纤维增强胶原基骨组织工程支架及制备方法

权利要求书

1.一类新颖的三维多孔纤维增强材料与人的骨髓间充质干细胞复合而成的骨组织工程支架。所述三维多孔材料由矿化胶原MC、高分子聚合物聚乳酸PLA以及天然甲壳素纺织成的高强纤维CHF复合而成。

2.根据权利要求1所述的胶原为I型牛皮胶原；高分子材料聚乳酸PLA为聚L-乳酸或聚D,L-乳酸，分子量为1.0×10⁵-2.0×10⁵kDa；甲壳素纤维CHF的断裂强力为4.5-4.7cN，其表面经过脱乙酰基处理，脱乙酰度为80-85％。

3.根据权利要求1所述的矿化胶原MC是由胶原经钙盐溶液与磷酸盐溶液处理后得到，它不但提高了其力学整合性，也使得材料的成分更加接近于天然骨。聚乳酸PLA对整个三维材料起支撑作用，通过溶于有机溶剂并在模具中冷冻干燥，得到多孔材料。甲壳素纤维CHF的功能之一是起增强作用，功能之二是因为它的降解产物本身具有明显的碱性，从而在体内中和聚乳酸的酸性降解产物。

4.根据权利要求1所述的三维多孔材料采用物理混合和超声波分散技术相结合的方法复合而成。采用模具成型和随后的冷冻干燥以获得三维多孔结构。所述人的间充质干细胞为hBMSC为人胚胎骨髓间充质干细胞。整个骨组织工程支架的制备方法包括下列各步骤：

(1)制备矿化胶原MC。首先将胶原溶解于乙酸中，然后在胶原溶液中依次缓慢滴加等量体积的0.5M CaCl₂和0.3M Na₂HPO₄，之后在搅拌同时缓慢滴加NaOH溶液至pH值为6～8。静置溶液2～4天，除去上清，离心分离出沉淀，沉淀物用去离子水反复清洗三次后，放入冻干机内冷冻干燥，随后研磨制得干粉即为矿化胶原MC。

(2)确定合适的聚乳酸PLA和甲壳素纤维CHF添加比例。PLA和CHF按不同比例分别浸泡于含有一定溶解酵素的PBS溶液中，分别在一定时间内测定浸泡液的pH值，最后选用pH值波动较小的PLA和CHF的添加比例。经过反复实验得出当CHF和PLA的质量含量之比为0.25-0.3时，材料浸泡液pH值波动最小。

(3)确定甲壳素纤维CHF的合适长度。纤维只有在其长度大于一个临界长度的情况下，才能对基体产生增强作用。但是在纤维含量一定的情况下，如果纤维的长度太长，增强材料的压缩强度会略有下降。在本试验所能涉及的范围内，经过多次重复，得到甲壳素纤维CHF的合适长度为1.4-1.6mm。

(4)将分子量为1.0×10⁵-2.0×10⁵kDa的聚乳酸PLA溶于1,4-二氧六环中，配成浓度为100-150g/L的溶液。加入一定含量矿化胶原MC粉末（PLA：MC=1），超声波分散30-60min，然后加入加入一定含量的甲壳素纤维CHF（CHF：PLA=0.25-0.3），在常温下经过2-4小时的磁力搅拌并超声波分散3-5小时，制得骨组织工程材料混合液体。

(5)采用冷冻干燥的方法制备三维多孔骨组织工程材料。将上述第4步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20℃冰箱中冷冻24-48小时后，将模具转移到冷冻干燥机中冷冻干燥24-36小时，为了将溶剂彻底清除，冷冻干燥后的材料需在40-60℃的真空干燥箱中烘干24-48小时。之后，将材料用环氧乙烷蒸气消毒6-12小时，即为本发明所述的三维多孔骨组织工程材料。

(6)人的骨髓间充质干细胞hBMSC与三维多孔材料共培养。将购买到的2-3代人胚胎骨髓间充质干细胞以1-3×10³cells/cm²的密度接种在上述第5步制备的三维多孔骨组织工程材料上，待4-6小时细胞贴壁后加入含有10%的胎牛血清DMEM培养液,培养液每3天换新液。7天后用PBS冲洗三次材料以除去没有粘附到材料的细胞。最终得到本发明所公开的复合人的骨髓间充质干细胞的甲壳素纤维增强胶原基骨组织工程支架。