[发明专利]高通量微流控芯片检测系统的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于抗体与核苷酸交联的高通量微流控芯片检测系统的构建方法。

背景技术

尽管基因芯片的研究已取得了很大进展，但仍有报道表明，其结果不适用于生命过程中真实蛋白性状的表达。随着蛋白组学概念的提出，及蛋白质作为生物活动的最终表现形式，能直接真实地反应研究结果，人们需要一种高通量分析蛋白的技术进行深入研究，蛋白芯片技术就这样应运而生。

蛋白芯片作为生命科学领域的一种新兴技术，如今已在食品卫生检疫、医学诊断、新药研制等方面得到越来越广泛的应用。而在生物样本量较少的情况下，蛋白芯片更是发挥了巨大的作用，能够同时并行检测多个指标。然而蛋白质作为生物大分子的不稳定性，蛋白芯片在发展过程中遇到了瓶颈。

蛋白芯片的制作方法主要分为两类：直接点样法和微流控法。点样法顾名思义，主要采用芯片点样仪将特异性蛋白在芯片基质上进行微阵列排列，然后点上检测样品反应，最后对反应结果进行扫描。这种方法可以比较简便地实现高通量的要求，但是其反应在基质表面进行，受外界环境影响大，容易破坏蛋白质的空间构象，使其在检测之前就变性失活，灵敏度低，更无法长期保存。

微流控法使蛋白质的特异性反应在液体环境中进行，整个系统包括泵、封闭的反应腔、流路等，负责微量流体的传感、输送、检测和控制。反应结果通常由微流控系统中的扫描仪进行定量、全面的分析。微流控法具有相当优势：长期有效，不易污染，即有效解决了抗体降解和表面沉淀问题；检测样品用量很小；全面检测和分析；应用范围广泛，可以用于卫生检疫、药物研制等各个方面。但是缺点在于，由于微流控芯片通路有限，其高通量的实现有一定难度，一般通量仅为1~2。

核苷酸与蛋白的交联技术已经较为成熟，但人们对于该领域的研究主要集中于Immuno-PCR领域，该技术基于蛋白的免疫反应，通过核苷酸与蛋白的交联，最后以PCR方法扩大免疫反应的信号，增强检测灵敏度，如Ruzicka于1992年在science上的报道。本发明首次将此类交联体用于高通量的微流体系统，而在微流控系统中使用交联体将高通量的microRNA芯片转换为高通量的抗体芯片是本发明的主要创新点。Kozlov等在2004年报道了通过腙键交联的核苷酸与蛋白交联体具有较高的稳定性。

目前尚没有将交联体运用到微流体芯片的内容被公开发表过。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于抗体与核苷酸交联的高通量微流控芯片检测系统的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量微流控芯片检测系统的构建方法，依次包括以下步骤：

第一步：基于μParaflo^TM微流体生物芯片原位合成若干种(例如为6种)不同序列的单链寡核苷酸，该核酸的3’端与芯片底部相连；

第二步：合成针对若干种(例如为6种)转基因蛋白的抗体-寡核苷酸链复合物探针；包括如下步骤：

1)、准备若干种(例如为6种)转基因作物蛋白的抗体探针；

2)、合成若干种(例如为6种)核酸序列；

3)、对相应抗体和寡核苷酸链进行交联；包括如下步骤：

A、抗体的修饰与脱盐：

将6种抗体分别进行以下操作：

取45~55μg抗体溶液，加入分子截留量为50kDa的超滤膜中，再加入280~320μL的pH7的修饰缓冲液(SoluLink)，离心，至膜上留下的液体为19~21μL，然后用SANH溶液(浓度为6.89×10^-2mol/L，Succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone，即，琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙)修饰，SANH与抗体之间的摩尔比为50~70：1；再放置于24~26℃的摇床中孵育修饰3~5小时；

孵育完后将产物洗涤、离心，以除去多余的作为修饰剂的SANH，用pH 6的交联缓冲液(SoluLink)洗涤，使抗体被置换到交联缓冲液中，然后收集脱盐后的抗体修饰产物(使脱盐后余下的液体体积保持在40~50μL左右)；

B、核苷酸的修饰与脱盐：

用pH 7修饰缓冲液(SoluLink)将核苷酸(即单链DNA)冻干粉配置至8~12mg/mL，然后用SFB溶液(8.094×10^-2mM，Succinimidyl 4-formylbenzoate，即琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)修饰；SFB与核苷酸之间的摩尔比为50~70：1；放置于24~26℃的摇床中，孵育修饰3~5小时；