[发明专利]基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法及其在CTD-PAH中的应用

说明书

技术领域

本发明属于临床自身抗体检测领域，具体涉及基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法及其在结缔组织病合并肺动脉高压中的应用。 

背景技术

肺动脉高压（PAH）是不同原因导致的肺循环疾病，最终引起不可逆的肺血管重构和右心衰竭，自然病程的中位数存活时间仅为2~3年。结缔组织病（CTD）所致的PAH是肺动脉高压疾病谱的重要组成部分，国外的报道显示CTD-PAH占所有PAH的10%，而国内的资料该数字接近20%；西方的数据显示系统性硬化症（SSc）在CTD-PAH中占绝对主导，而我国则是系统性红斑狼疮（SLE）为导致CTD-PAH的首要原因（构成比达40%）。 

在过去10年中，随着以内皮素受体拮抗剂、前列环素类似物、磷酸二酯酶抑制剂为代表肺动脉高压靶向治疗的问世，各种PAH的总体预后确实得到了改善，但CTD-PAH患者的预后仍明显低于特发性PAH患者。以SLE为代表的CTD-PAH显然存在特有的免疫病理机制，而发展其免疫病理特征性的生物标记物，势必有助于早期捕捉、预测PAH的发生和进程，为更有针对性的靶向性干预提供依据。 

内皮素受体通路是PAH公认的致病通路之一，其活化对PAH的肺血管重构起到了关键作用。已有德国学者发现了SSc中存在抗内皮素受体A抗体，并建立了基于内皮素受体蛋白全长的ELISA检测方法（Riemekasten G,Philippe A,  M,et al.Involvement of functional autoantibodies against vascular receptors in systemic sclerosis.Ann Rheum Dis.2011Mar;70(3):530-6.)。其研究结果显示，抗内皮素受体A抗体与SSc的病情严重性存在正相关；体外的功能实验则提示该抗体存在活化内皮素受体通路的致病功能。该发现提出了一系列问题需要进一步解决：（1）抗内皮素受体A抗体（anti-ENRA）是否存在于其他CTD?（2）anti-ENRA与CTD-PAH是否存在关联，换言之，其是否能够成 为CTD-PAH（特别是未经报道、而在国人当中更为常见的SLE-PAH）的生物标记物？（3）anti-ENRA作为可能具有致病功能的自身抗体，其存在是否对内皮素受体拮抗剂的个体化应用提供依据？（4）从临床检测的技术层面，由于内皮素受体是7次跨膜的G蛋白偶联受体，其全长的真核表达代价昂贵，能否通过表位分析进而合成抗原肽，以优化并低成本化anti-ENRA的检测方法、提高其临床检测实用性？这些问题急需得到解决。 

发明内容

针对已有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供基于内皮素受体A表位抗原肽的anti-ENRA抗体酶联免疫检测方法，以克服现有技术存在的代价昂贵的缺陷。 

本发明的目的之二是提供该方法在CTD-PAH作为生物标记物检测的应用。 

本发明目的之三是提供内皮素受体A表位抗原多肽片段用于制备诊断和评估结缔组织病合并肺动脉高压以及定性和定量检测人血清中抗内皮素受体A抗体的试剂和试剂盒。 

本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的： 

在前期首先在CTD-PAH的血清中证实存在抗内皮素受体A（而非内皮素受体B）的自身抗体，建立了基于ENRA全长重组蛋白的anti-ENRA的ELISA方法。进而聚焦于独立样本的SLE-PAH，确证了超过40%的患者存在anti-ENRA（如图1所示）。 

一种基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，内皮素受体A是一个7次跨膜的G蛋白偶联受体，由347个氨基酸序列构成，除一段信号肽外，共有4个长度不一的胞外肽段。循环中的自身抗体应与其胞外肽段构成的抗原表位结合。本发明就是通过合成了上述4条胞外肽段，筛选到了与全长ENRA一致性良好的表位肽段（如图2所示），由人工合成该表位肽段作为抗原肽包板，并就此建立了基于内皮素受体A表位抗原肽的anti-ENRA抗体酶联免疫检测方法。所述肽段为内皮素受体A的氨基酸序列为（是内皮素受体A的21~76位的56个氨基酸序列）： 

DNPERYSTNLSNHVDDFTTFRGTELSFLVTTHQPTNLVLPSNGSMHNYCPQQTKIT。 

所述表位抗原肽包括所有氨基酸序列，及其排列顺序。 

基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，具体步骤如下：