[发明专利]利用GST表达体系制备的Fertilin Beta胞外段高效价抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗体及应用。 

背景技术

受精素β(Fertilin Beta)是一种精子表面特异性跨膜糖蛋白，定位在人类8号染色体上，其特异性的表达在人类睾丸组织和精子中，在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合中发挥重要作用。 

Fertilin Beta蛋白功能及作用机制应深入的研究和探索：受精素在精卵结合和融合中怎样发挥作用；受精素在精子成熟过程中的促进作用等等。而研究一种新的蛋白质的功能，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的FertilinBeta蛋白高效价抗体对于系统研究Fertilin Beta在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合中的作用机制意义重大。 

发明内容

本发明的目的是建立一种能够用于Fertilin Beta蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入研究Fertilin Beta蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。 

利用基因工程技术，将Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测，并应用免疫荧光检测了Fertilin Beta蛋白特异性定位于精子头后部。 

本发明的GST-Fertilin Beta融合蛋白是将利用特殊序列(Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段)构建GST-Fertilin Beta融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的GST-Fertilin Beta融合蛋白，这段341-373位氨基酸序列为： 

Glu Ala Ile His Phe Ser Gly Val Lys Ile Phe Ser Asn Cys Ser 

1                   6                   11 

Phe Glu Asp Phe Ala His Phe Ile Ser Lys Gln Lys Ser Gin Cys 

16                  21                  26 

Leu His Asn 

31 

其对应核苷酸序列为： 

gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca60 

cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat99 

这种GST-Fertilin Beta融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤： 

第一步，克隆载体的构建 

从人Fertilin Beta基因全长上应用PCR技术以基因组为模板，扩增得到的目的片段与pMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。 

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建 

将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得Fertilin Beta基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。 

第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的诱导表达和纯化 

重组质粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-Fertilin Beta融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。 

第四步，兔抗Fertilin Beta抗血清的制备及纯化