[发明专利]一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用。

背景技术

细菌产生耐药性是人类在病菌控制和治疗中碰到的一个棘手问题，对抗生素产生耐药性的细菌正在成为日益严重的威胁，并且变得越来越普遍。而抗生素的过度使用导致细菌产生多重耐药性，从而使人类面临“超级细菌感染”的危险[1]。大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最易产生耐药性的细菌，2011年5月在德国爆发的肠出血性大肠杆菌(EHEC)疫情就是由一种名为“husec41”的肠出血性大肠杆菌(EHEC)变种引起的，这一变种对很多抗生素具有耐药性。抗生素在畜牧业中的滥用也导致多种动物源大肠杆菌具有了一定抗生素耐药性[2]，这使得畜牧业的稳定和健康发展时刻面临巨大的威胁。要解决具有多重耐药性的超级细菌对人类健康和畜牧业发展的威胁，除了加强对抗生素使用的规范管理，减少抗生素的滥用外，最根本的办法还是要加快抗生素的研发速度，开发出新的、更为有效的抗生素。只有不断采用新的研究技术和工艺，才能加快抗生素的研发速度。

虽然体外细胞实验可以很好地阐明病菌和宿主之间相互作用的关键步骤，但是无法获得与整体动物相关的一些重要信息。随着生物学技术的进步和动物替代模型的出现，曾经阻碍用活体动物进行病菌毒性研究的技术障碍和伦理问题都已经得到了很好地解决。常用的较为低等的病菌感染替代动物模型包括果蝇[3]、线虫[4，5]和阿米巴虫[6]等一些发育生物学研究已经很广泛的动物，对这些低等动物发育生物学的深入研究已经为医药学家提供了大量的实验工具和实验材料。但是，果蝇和线虫等低等动物与人类的生物等级差别太大，基因相似度低，生理结构和生理功能有较大差别，因此，其药物实验结果的预测可靠性与可比性较差。所以，迫切需要开发新的较为低等的动物模型，以便既能替代大小鼠等高等动物，又能保证实验结果的预测可靠性与可比性较高。斑马鱼是一种硬骨鱼，属于脊椎动物，与果蝇、线虫和阿米巴虫等低等相比，斑马鱼与人类的基因相似度更高(85％以上)、生理结构和生理功能更为接近；与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[7]。此外，斑马鱼有着与哺乳动物非常相似的发育良好的免疫系统(包括先天性免疫和获得性免疫)[8，9]。这些优点使得斑马鱼成为了研究病菌感染机制和筛选抗生素的一种非常有用的动物模型。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷和不足，发明人经研究，旨在提供一种简单、快速、经济、高通量的斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1.一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)斑马鱼选取

挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；

(2)细菌注射

设置若干个细菌注射组、1个溶剂注射组、1个空白对照组，将带有荧光标记的细菌用灭菌的1×PBS缓冲液洗脱3次，然后用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内，注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水，作为细菌注射组；溶剂注射组注射等体积灭菌的1×PBS缓冲液；空白对照组注射等体积的养殖用水；恒温培养。

优选的，还包括以下步骤：

(3)图像分析和/或微孔板分析；

(4)统计学分析。

优选的，步骤(1)中挑选的斑马鱼为受精后2天的斑马鱼；

优选的，步骤(2)中每个斑马鱼细菌注射量为3000-3500CFU；

优选的，步骤(2)中的注射方式为心包注射或卵黄囊注射；

优选的，步骤(2)中细菌为大肠杆菌；

优选的，所述养殖用水其溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L；

优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的温度为34℃；

优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的时间为72h。

优选的，图像分析具体步骤为：移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为0.64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3％甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3.10高级图像处理软件对图像进行分析，计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度；

优选的，微孔板分析具体步骤为：将斑马鱼转入96孔板，每孔1尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；