[发明专利]一种奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用

权利要求书

1.一种奶山羊PLZF基因，其特征在于，其基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一种奶山羊PLZF基因，其特征在于，该基因的CDS序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，在奶山羊PLZF基因的下游连接荧光报告基因。

4.如权利要求3所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。

5.一种基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，其特征在于，包含SEQ.ID.NO.2所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游连接荧光标记基因GFP，在GFP的下游连接抗生素筛选基因kan^r/neo^r。

6.如权利要求5所述的基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，其特征在于，所述的基于PLZF基因序列构建的表达载体为pPLZF-IRES2-EGFP表达载体，通过Ecor Ⅰ和BamH I酶切位点将PLZF基因克隆到pIRES2-EGFP表达载体。

7.奶山羊PLZF基因序列转染到奶山羊雄性生殖干细胞中以促进其自我更新的应用。

8.一种促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）克隆如SEQ.ID.NO.1所示的奶山羊PLZF基因序列，并将PLZF基因序列通过Ecor Ⅰ和BamH I酶切位点克隆到pIRES2-EGFP表达载体中，得到pPLZF-IRES2-EGFP表达载体；

2）将待转染的奶山羊雄性生殖干细胞与pPLZF-IRES2-EGFP表达载体共同孵育，将pPLZF-IRES2-EGFP表达载体转染到雄性生殖干细胞之中；

转染后3～4h，将奶山羊雄性生殖干细胞在基本培养基上添加其体积10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及0.1mmol/L的β-巯基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺进行培养；所述的基本培养液为DMEM/F12培养液或H-DMEM培养液；

并在荧光显微镜下对荧光标记基因进行观察，筛选启动自我更新相关基因表达水平增高的细胞。

9.如权利要求8所述的促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，其特征在于，还以人的293T细胞的转染作为对照，该细胞所采用的基本培养液为H-DMEM培养液。

10.如权利要求8所述的促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，其特征在于，所述的启动自我更新相关基因为PCNA、C-MYC、OCT4、PLZF、CDK2和CYCINA1。